Question

绿色荧光蛋白的蛋白应用

Answer 1

骨架和细胞分裂
Kevin Sullivan's 实验室
酵母菌内SPB 和微管动力学
酵母菌中肌动蛋白的动力
果蝇中MEI-S332蛋白
果蝇有丝分裂和mRNA运输
网丙菌属细胞骨架
RNA剪切因子的核内运输
网丙菌属的趋化作用
网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动
核动力
网丙菌属中细胞动力
细胞骨架动力和胞内运输
动力学和泡囊运输
用GFP显示小囊运输
用GFP观察TGN运输
细胞骨架动力学和胞内运输
发育生物学
用GFP观察线虫的神经发育
分析果蝇神经发育的不对称性细胞分裂
线虫Lin-14
Fischbach lab
用GFP观察网丙菌属的形态发生学
GFP在小鼠发育中的标记方法
生物技术中的应用研究
1．分子标记
作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。
2．药物筛选
许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。
在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR）的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。
3．融合抗体
近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越性在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。
由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。
4．生物传感器
蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla）融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白（BLIP）与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。
肿瘤发病机制的应用
GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。
在信号转导中的应用
新近研究发现，某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,FRET）。FRET 是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。FRET 发生的前提条件是，荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内，则非常利于 FRET 的产生。因为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 （在纳米范围内）。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于 FRET 能量转移并非是 100 % 的效率，一个实用而有效的检测 FRET 的方法是，仅仅激发荧光供应分子，然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针，现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET。
研究发现可以通过调节 GFP 来改变 FRET。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上，并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子,这两个 GFP 恰好可以发生 FRET，当加入蛋白酶时，间隔子被切除，两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变，FRET 被完全阻断。该实验提示我们，可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子，来动态观测活细胞的生理功能。
在上述实验基础上，研究人员开始设计 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂，其设计原理是，钙调蛋白 (CaM) 通过肌球蛋白轻链激酶(MLCK) 结合到 CaM 结合区。蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白通过 CaM 和 MLCK 区域融合在一起，当 Ca 2 + 增多时，形成更多的 Ca 2+ - CaM 复合物，并从 MLCK 结合到 CaM 结合区域。该实验发现，通过改变两个 GFP 之间的距离，可以增加 FRET。另有一些研究人员，并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中，而是把一个 GFP 融合到 CaM 上，另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域。结果发现，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，出现分子间异源二聚体，两个 GFP 足够接近而产生 FRET。这个实验提示了一个非常重要的现象，即 FRET 不仅可以在分子内发生，而且还可以在分子间发生。
最近，有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学，通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞，观测有关 cAMP 的动态荧光变化。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位，设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时，两个荧光分子距离很近，并出现 FRET，如果增加 cAMP 浓度，发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法，可以检测出 cAMP 的动态变化,并开创了在整体条件下，研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。
GFP 的结构虽然具有高度完整性，但是实验中发现，在 GFP 中某些确定的位置，插入外源基因，完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中，得到 Ca 2+ 传感器，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，导致生色团去质子化，使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构，可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP，结果发现荧光少量增加，为改变前的 1.7 倍，K d 值约 0. 4mmol。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象，提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。
光伏发电
瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的绿色荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。
神经生物学
神经极性发育
tracking intracellular transport of peptide neurotransmitters using GFP Allen Lab
Enhancer trapping using tau-GFP as reporter localized to axons
其他应用
Cell surface organization in Natural Killer cells Dan Davis
localization of calmodulin in S. pombe with GFP
GFP-plakoglobin and expression plasmids Klymkowsky lab
Molecular Motion Laboratory Yale University
Measuring diacylglycerol in vivo with a GFP-PKC chimera Tobias Meyer
Bentley Lab using GFP for on-line bioprocess monitoring & control
Tracking viral proteins with GFP fusions
GFP vectors and technology
Clontech Inc.Supplier of constructs for making GFP fusions
DeltaVision 3D microscopy platform optimized for imaging GFP in living cells in real time
GFP Expression Truly Amazing Web Site about GFP technology
Universal Imaging Corp. makers of the MetaGFP image processing platform
Quantum Biotechnologies IncSuppliers of GFP and BFP constructs
GFP in Arabidopsis
BabCo/Covance antibody to GFP
Lightools GFP plate illumination systems
GFP in Chlamydomonas
Other Interesting GFP Links
GFP Resources for Teachers
Picture of Aequoria victoria,source of GFP
Structure of green fluorescent proteinFull text of Yang et al Nature Structural Bio paper
Table of GFP mutant forms
Optics in Cell Biology
应用前景
野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能，而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。为了改善 GFP 荧光特性 （如摩尔吸收值及释放波谱），对 GFP 进行了突变和重组实验。Chalfie 等 通过测定大肠杆菌和线虫体内重组 GFP 的荧光光谱发现，它和提纯的天然 GFP 光谱完全一致。突变实验发现，多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性，但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。例如用 The 替代 Ser 65，在 490 nm 处出现一个单一激发峰值，激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍，对光淬灭具有更强的抵抗性，并且出现红移现象，该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 ; 同样 Leu 替代 Phe 64，即增加 GFP 的可溶性，荧光强度增强 35 倍。3 个氨基酸同时突变时，在 360 nm 至 400 nm 之间，出现最大激发峰，而且增大生色团形成的机率，可溶性更强，荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。现有人认为，低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一，为此，研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP，并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度。此外，用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。许多 GFP 突变蛋白，不仅改变了激发和释放波谱，而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等。
不同的突变体给应用提供了更广阔的前景，但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值，发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合。GFP 依赖的 pH 检测子，与小分子染料不同，这种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系列问题，且 GFP 具有高度选择定位性，适合于所有对于基因转染敏感的细胞。更重要的是，这个实验说明利用组织特异性启动子GFP 检测特定组织,通过融合到目的蛋白，可以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到达部位 pH 值的可能性。
荧光蛋白已有非常广泛的应用，GFP 可应用于转染细胞的确定，体内基因表达的测定，蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示，细胞间隙pH 变化的检测。另外，GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白，作为基因治疗检测指标。但是，GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 :⑴荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，⑵多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测，⑶实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株，可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关，(4)另外，需要注意，由于GFP本身分子量较大，以融合蛋白形式表达的GFP有可能对蛋白本身的细胞定位等特性产生影响，在使用GFP作为标签时需要进行仔细分析。