Question

分子生物学中应该知道的那些事儿（二）

Answer 1

主要内容：

一、硅基质离心柱制备DNA和RNA的工作原理

1. 裂解

裂解方法可能会根据需要DNA或RNA而有所不同，但其共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

杂化使氢键不稳定，范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定，包括核酸酶，核酸与水的结合被破坏，为核酸与硅机制结合创造条件。

离液盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

除了离液盐，裂解缓冲液通常还含有洗涤剂，有助于蛋白质的溶解和裂解。

根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶k就是其中之一，实际上蛋白酶k在裂解缓冲液中起着非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好，蛋白质变性越完全。然而，溶菌酶在裂解缓冲液的变性条件下不起作用，因此，通常在加入变性盐之前进行溶菌酶处理。

对于质粒的制备，裂解方式与提取RNA或基因组DNA有很大不同，因为必须先从基因组DNA中分离出质粒。

如果加入离液盐，将立即释放胞内物质，并且无法从高分子量染色体中区分出小的环状质粒。

因此，在质粒制备中，直到裂解后，才加入离液盐，并用于结合硅基质。

2. 结合硅基质（Binding）

离液盐对裂解和硅基质的结合至关重要。

为了增强核酸与硅基质的结合，在结合阶段还加入了乙醇。通常是乙醇，但有时可能是异丙醇。

乙醇的浓度和体积对结合有很大影响，浓度或体积太多会带来大量降解的核酸和小片段，进而影响UV260的读数，使核酸浓度降低。浓度或体积太少，可能很难洗掉膜上的残留盐。

重要的一点是，乙醇会影响结合，并且添加的量对于任何试剂盒都是优化的。修改该步骤有助于获得核酸提取的效果，因此如果遇到问题并希望排除原因，则可以进一步评估该步骤。

另一种问题的诊断方法，保留离心后过柱滤液，并进行沉淀操作，看是否有核酸。如果在裂解过程中使用SDS的表面活性剂，试着用NaCl作为沉淀剂，以避免污染DNA或RNA。

3. 洗涤步骤

裂解液通过硅胶膜离心，现在DNA或RNA与柱结合，杂质，蛋白质和多糖则通过。

但是，膜仍然会被残留的蛋白质和盐弄脏。如果样本来自植物，膜上仍会残留多糖，可能还有一些色素，或者如果样本是血液，膜可能呈棕色或黄色。

清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式，但因样本类型而异。第一次洗涤通常会用少量的离液盐来去除蛋白质和有色污染物。然后用乙醇清洗以除去盐。如果样本本身没有太多蛋白质，如质粒准备或PCR产物纯化，那么只需要乙醇清洗即可。

4. 离心柱的干燥

乙醇洗涤后，大多数操作步骤都有离心来干燥离心柱。这是为了去除乙醇，是清洁洗脱的必要步骤。当10mM Tris缓冲液或水填充到膜上进行洗脱时，核酸会水合并从膜上释放。如果柱上还有乙醇，那么核酸就不能完全再水化。

跳过干燥步骤会导致乙醇污染和核酸产量降低。

这个问题的主要迹象是当试图把样品加载到琼脂糖凝胶上时，即使在存在染料的情况下，DNA不会下沉，而是漂浮在缓冲液中。乙醇污染的另一个迹象是，如果你把样品放在-20摄氏度，它不会结冰。

5. 洗脱

最后一步是从硅基质中释放出纯DNA或RNA。对于DNA的处理，通常使用pH值在8-9之间的10 mM Tris。DNA在稍微碱性的pH下更稳定，在缓冲液中溶解更快。即使是DNA颗粒也是如此。水往往趋向于低pH值，低至4-5，在短时间内洗脱时，高分子量DNA可能不完全水化。通过让缓冲液在离心前在膜中停留几分钟，可以最大限度地洗脱DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下稳定，因此水是首选洗脱液。RNA很容易溶于水。

6. 离心柱操作时容易出问题的事儿

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解问题，或者是过柱结合时条件出现了问题。

确保使用新鲜的优质乙醇（100%）稀释缓冲液或添加到过柱结合步骤。

质量差的乙醇或者长期储存的乙醇可能吸水，导致乙醇浓度发生变化，如果洗脱缓冲液的配置出现问题，DNA或RNA就会被清洗时流失。

低纯度：如果样品被蛋白质污染（低260/280），那么可能是因为样品太多，蛋白质没有完全去除或溶解。如果样品的260/230比率很低，则问题通常是来自结合缓冲液或洗涤缓冲液中的盐。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，则提取是增加洗涤次数。

与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为在提取过程中腐殖物质会被溶解。腐殖质类似于DNA，很难从硅胶柱中除去。对于这种类型的样品，在过柱步骤之前需要使用去除蛋白质和腐殖质的专门技术。

降解： 主要是RNA，降解是由于样品储存不当或者裂解效率过低造成的，不过前提是用不含RNase的水洗脱，对于DNA预处理来说，降解并不是一个大问题，因为对于PCR来说，DNA有降解，扩增依旧可以良好进行。但如果不希望DNA剪切过于严重，那么不要使用太强的裂解方法。  PCR纯化注意事项： PCR纯化是所有硅基质离心柱技术中最简单的，因为它只需要添加高浓度的结合盐（通常在每个PCR反应体系中添加3-5倍体积）并离心柱体。因此，当PCR纯化试剂盒操作失败时，可能会特别令人沮丧。所以纯化前，最好在凝胶上检测一下扩增结果。

PCR反应体系中太多物质可在UV260处有吸收峰： 核苷酸、洗涤剂、盐和引物。PCR纯化试剂盒操作失败多数是因为没有获得扩增产物。

如果确定反应体系中，有PCR产物且浓度不低，可以保留过柱后的液体，如果DNA没有发生结合，还可以进行挽救，重新进行纯化。

二、DNA连接酶工作原理

DNA连接酶（EC 6.5.1.1）以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或配对的粘性末端连接起来，其作用是修复DNA分子中断裂的双链。

在分子生物学中，它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载体。商业连接酶提供含有ATP和Mg2+的反应缓冲液，这两种物质对连接酶活性都是必不可少的。

由于反复的冻融可能会破坏ATP，所以最好将溶液进行分装。

链接反应本身有两个基本步骤。首先，DNA末端必须偶然碰撞，并保持在一起足够长的时间，以便连接酶连接它们。

低温反应更容易。所有的分子在更高的温度下移动得更快，如果它们在低温下轻轻地漂浮在溶液中，而不是像在更高的温度下那样呼啸而过，那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端，较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键，有助于保持性对位置。

第二步是酶促反应：DNA连接酶通过两步催化3′-OH与5′-磷酸基团连接。首先，与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核苷酸被转移到5′-磷酸。然后磷酸腺苷键被3′-OH攻击，形成共价键并释放腺苷酸。为了让酶进行进一步的反应，酶活性部位的AMP必须由ATP补充。

DNA连接酶在25℃时具有最佳活性，因此连接反应在使DNA末端连接在一起的最佳温度（1℃）和酶反应（25℃）之间的权衡温度下进行。通常在16℃下1小时是可以的，但是由于将DNA末端连接在一起是反应中最不有效的部分，因此通过将温度降低到4℃来促进这一点可以提供更高的效率。 然而，酶在这个温度下工作非常缓慢，因此需要很长的（如过夜）反应时间。

三、比色分析的工作原理

1.对硝基苯基磷酸酯—分析机制

对硝基苯磷酸酯（pNPP）作为一种合成底物广泛应用于各种磷酸酶的催化活性测定。pNPP的磷酸基团被酶裂解生成对硝基苯酚，由于对硝基苯酚在水中电子激发的最大波长为318nm，因此对硝基苯酚也是无色的。然而，在碱性条件下，对硝基苯酚转化为对硝基苯酚阴离子，导致向400nm左右的深色偏移（根据溶液条件将化合物的吸收峰改变为较长波长）。这是电磁光谱的蓝色边缘，但是由于我们看到反射光的颜色（与吸收光相反），溶液看起来是黄色的。

要记住的事情：

铬酸盐转移是分析的关键因素。

举例来说，如果酶的活性要求在酸性范围内有一个最佳的pH值，那么酸性磷酸酶的情况正好如此。

在这种情况下，为了获得所需的黄色，必须在终点添加强碱（例如氢氧化钠或氢氧化钾）。

2.孔雀绿—分析机制

对硝基苯磷酸测定是很好的，但是如果你最喜欢的磷酸酶不能有效地代谢pNPP呢？另一种市面上可买到的磷酸酶测定法是孔雀绿测定法。这种简单的测定方法是基于孔雀绿、钼酸铵和游离正磷酸盐（又称无机磷酸盐，pi）在酸性条件下形成的络合物。

正磷酸盐被磷酸酶分解后从磷酸化底物中释放出来，在硫酸溶液中与钼酸铵形成络合物。孔雀绿磷钼酸盐络合物的形成，在620-650nm处测量，与游离正磷酸盐浓度直接相关。因此，有可能量化蛋白质磷酸酶底物的磷酸化和磷酸释放。

要记住的事情：

这种方法仅测量无机游离磷酸盐；在测量之前，必须首先水解和中和有机磷酸盐（脂质结合或蛋白质结合磷酸盐）。了解不同种类的有机磷酸盐及其各自不同的水解自由能有助于优化分析条件。高能有机磷酸酯（缩醛磷酸酯、酸酐等）具有不耐酸的磷酸基团，可在低pH下孵育释放到溶液中。另一方面，低能有机磷酸盐（磷酸酯）在酸性溶液中稳定，需要更苛刻的条件（如热分解）才能用这种方法检测。

在大量孔雀绿存在下，3:1离子缔合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1:1离子缔合物，在溶液中加入聚乙烯醇。

在分析过程中要考虑的另一件事是任何可能干扰分析的氧化还原反应的可能性。钼是一种过渡金属，因此存在于多种氧化状态。在钼酸盐阴离子中，它具有+6的氧化状态。通过有机化合物，如抗坏血酸和还原糖（即葡萄糖）或无机化合物（如SnCl2）还原酸化的Mo（VI）溶液，生成颜色为蓝色的Mo（IV）物质。

四、实验室级用水是如何纯化的？

1.蒸馏：像山丘一样古老的技术（或者至少像隐藏在山丘里的静物一样）。水被加热到沸点，然后冷凝成液体。这样可以除去许多杂质，但沸点等于或小于水的杂质也会被带入蒸馏液中。

2.微滤：在这项技术中，利用压力迫使水通过孔径为1至0.1微米的过滤器，以去除颗粒物。直径小于0.2微米的过滤器可去除细菌，即所谓的冷杀菌。

3. 超滤，使用更小的孔径（小于0.003微米）。这些基本上都是分子筛，用来去除直径大于孔径的分子。它可以用来清除病毒、内毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。

4.反渗透。反渗透过滤器的孔径小于0.001微米，这使得它们能够根据直径筛选离子。这是用来脱盐的水。

5.通过活性炭床过滤，有助于去除吸附在炭表面的氯离子和有机化合物等物质。

6.紫外线辐射。紫外线是一种很明显的去除水中微生物的方法。它还可以通过将某些有机化合物分解成危害较小的产物用来净化水。

7. 去离子/离子交换。将水通过含有阳离子和阴离子树脂混合物的树脂床来去除水中的离子。水中的正离子被阴离子树脂颗粒所吸引，而负离子被阳离子树脂所吸引。其结果是从树脂床的另一端流出去离子水。

销售纯水水或净水系统通常将使用这些技术的组合。水的纯度越高，使用的技术就越多。

五、为什么酶有最适温度

每个生物学家都熟悉酶反应速率与温度的关系，如图所示。

我们知道来自大肠杆菌或温血动物的酶在37℃左右有一个最佳温度，而来自热排气细菌的酶有更高的最佳温度。

为什么酶有一个最佳温度分布？化学家有一个经验法则，温度升高10℃会使反应速度加倍。这个规则是从Arrhenius方程推导出来的。

基本上，随着温度的升高，反应物的动能也随之增加。这种动能的增加意味着反应物更容易与足够的能量发生碰撞，从而使反应发生，因此温度越高，反应速率越高。

温度上升：反应速率曲线的第一部分，其中速率随着温度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果这种酶即使在高温下也完全稳定，反应速度也会随着温度的升高而继续增加，直到发生其他事情，比如其中一种反应物变得受限。

平衡：反应速率开始趋于平稳，这是由于温度接近该酶变性温度（因此失去活性）。

温度下降：在更高的温度下，酶完全变性，失活。

变性发生的温度取决于酶的结构，而这又与酶的进化起源有关。大肠杆菌的酶已经进化到可以应对37℃左右的温度，而来自热喷口细菌的酶则被迫进化到可以在更高温度下保持稳定的程度。

因此，酶的最佳温度是基于Arrhenius模式对温度的依赖性（反应越热，反应速度越快）和酶接近变性温度时的不稳定性之间的权衡。