Question

怎么设计引物

Answer 1

设计引物的方法如下：

1、引物长度一般在15-30bp。

引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2、引物GC含量一般为40%-60%。

引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。

Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。

4、引物3’端的碱基一般不用A。

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

6、引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

7、如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

8、引物5’端可以修饰。

引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

验证引物的特异性：

在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。

这里提供了7种数据库：RefSeq mRNA，Refseq representativegenomes，nr，RefseqRNA（refseq_rna），Genome（reference assembly fromselected organisms），Custom，and Genome（chromosomes from all organisms）。

推荐使用“Refseq representative genomes”数据库；Genomedatabase（chromosomes from all organisms）是NCBI染色体数据库的旧版本，不再推荐使用；Custom可以使用自己的序列作为搜索数据库。