Question

又被蛋白纯化折磨到哭泣，如果早知道这点就好了

Answer 1

RNA 完整性低，结果就一定差吗？是时候揭开真相了师弟发《Nature Plants》评教授，而我还在博士延期细数肿瘤免疫研究中 5 大小鼠模型，让你少查半个月文献哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了

在做蛋白纯化的时候，失败总是难免的，要么蛋白无法表达，要么表达的蛋白检测不到，还有就是蛋白无法挂柱……为了更好的帮助大家在蛋白纯化领域一步到位，之前写过一篇文章帮大家分析在哺乳动物表达系统中，亲和标签该如何选择：

传送门：哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了

其中Strep-tag® 标签（包含Strep-tag®II 或是Twin-Strep-tag®）搭配的Strep-tag® 纯化系统，纯化过程温和、目标蛋白纯度高，且相容于多种表达系统的特性，越发受到科研人员的欢迎。

优势原理

第三代Strep-tag®蛋白纯化系统，由Twin-Strep-tag®标签搭配Strep-Tactin®XT 组合而成，相比于之前一代（Strep-tag®II：Strep-Tactin®），亲和力接近共价，但连结仍为可逆，因此在温和的纯化流程中可以产出高纯度（纯度> 95%）、高产量的目标蛋白，且能保持目标蛋白活性。不仅如此，此系统在有表面活性剂的环境中仍有良好的纯化表现，并且多次清洗柱子也不会造成目标蛋白流失, 即使是量少的蛋白或是膜蛋白，也有良好的纯化效率。

图 1

应用案例

在研究实例中，文章作者使用了 Strep-Tag®系统成功的重组表达和纯化了乳胶清除蛋白（Latex Clearing Proteins, Lcps）1。 Lcp 是一种橡胶加氧酶，是仅有的被研究和生化表征的三种胞外橡胶加氧酶之一2，可被革兰氏阳性链霉菌属K30（LcpK30）利用，在天然橡胶上生长。由于天然橡胶作为日用品被广泛的使用，如密封袋，手套和轮胎等，产生的废弃物也因此永久的进入了环境之中。其主要成分顺-1，4 聚异戊二烯，可以被加氧酶裂解，反应生成的末端有醛、酮基的低聚类异戊二烯，可作为生物燃料或精细化学品的合成前体3。因此对橡胶加氧酶进行研究，具有十分重要的意义。

下面我们对比一下 Strep-tag®II- LcpK30分别搭配 Strep-Tactin®high capacity 与 Strep-Tactin®XT 的纯化效果。

图2

以SDS-PAGE 分析发现（图2），使用Strep-Tactin®high capacity 与Strep-Tactin®XT，均能得到大量高纯度的蛋白；相对而言，使用Strep-Tactin®high capacity 在洗脱最后一步时会流失少量蛋白。而使用 Strep-Tactin®XT 则能避免蛋白的流失。因此，使用两种树脂的蛋白质得率是不同的（图 3）。与 Strep-Tactin®high capacity 相比， Strep-Tactin®XT 可以多纯化出约 13％ 的 Strep-Tag®II-LcpK30，效率更高，价格更低。

图3

与二代 Strep-Tactin®相比，由于三代 Strep-Tactin®XT 与 Strep-Tag®II 有较高亲和力，可以让更强烈的洗涤步骤得以进行，同时不会损失目标蛋白。因此，Strep-Tactin®XT 可在生理条件下获得极高的蛋白质纯度，其高亲和力可以快速大量的纯化Strep-Tag®II-LcpK30，温和的洗脱条件又可以保持酶活性，为其三维晶体结构的成功测定提供了保障4。

不仅如此，Strep-Tactin®XT 还可用于变性条件下的纯化，或WB/ELISA，侦测目标蛋白，还可用来固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或是更进一步用以筛选治疗用蛋白质，工业用酵素等等，具有广泛的应用领域。

参考文献（向下滚动）

1. Röther W, Birke J, Grond S, et al. Production of functionalized oligo-isoprenoids by enzymatic cleavage of rubber. Microb Biotechnol 43: 1238–1433[J]. 2017.

2. Birke J, Röther W, Jendrossek D. RoxB is a novel type of rubber oxygenase that bines properties of rubber oxygenase RoxA and latex clearing protein (Lcp)[J]. Applied and environmental microbiology, 2017: AEM. 00721-17.

3.Birke J, Röther W, Schmitt G, et al. Functional identification of rubber oxygenase (RoxA) in soil and marine myxobacteria[J]. Applied and environmental microbiology, 2013: AEM. 02194-13.

4. Birke J, Röther W, Jendrossek D. Latex clearing protein (Lcp) of Streptomyces sp. K30 is a b-type cytochrome and differs from rubber oxygenase A (RoxA) in its biophysical properties[J]. Applied and environmental microbiology, 2015: AEM. 00275-15.

文章来源：iba

图片来源：iba

题图来源：站酷海洛

话题： Strep-tag, 蛋白纯化