Question

农杆菌转化法的原理

Answer 1

选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位点（以上这些构成了一个T-DNA区）。先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，派凯再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因正羡慎。我们称这段T-DNA区为目的片段。农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移（此处可参见词条双元表达载体系统），从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成，使得新生细胞均含有该举敬目的片段的基因。