DNA复制的过程
研载生物科技（上海）有限公司_
2023-04-12 广告
DNA双螺旋的解旋
DNA在复制的时候，在DNA解旋酶的作用下，双链首先解开，形成了复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质和酶参与的较复杂的复制过程
（1）单链DNA结合蛋白（single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白）
ssbDNA蛋白是较牢固结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白和DNA结合时表现出协同效应：如果第一个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第二个的结合能力可高达103；真核生物细胞里的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，以四聚体的形式存在于复制叉处，等待单链复制后才脱下来，重新循环。因此，ssbDNA蛋白仅保持单链的存在，是不起解旋作用。
（2）DNA解链酶（DNA helicase）
DNA解链酶可以通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这一种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。若双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶能首先结合在这一部分，然后逐步向双链的方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶沿滞后模板的5’—〉3’方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着3’—〉5’方向移动。因而推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。
（3）DNA解链过程
DNA在复制前不仅为双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在为解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外有一些特定蛋白质，比如大肠杆菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部双链被解开，就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开单链，保证此局部不会恢复为双链。两条单链DNA复制的引发过程是有所差异，可是不论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA合成。因此前导链和后随链的差别在于前者从复制起始点开始按5’—3’持续的合成下去、不形成冈崎片段、后者则随着复制叉的出现、不断合成长约2—3kb的冈崎片段。
冈崎片段与半不连续复制
因为DNA的两条链是反向平行的，所以在复制叉附近解开的DNA链，一条为5’—〉3’方向，另一条为3’—〉5’方向，两个模板极性是不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均为5’—〉3’方向，不为3’—〉5’方向，所以无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本的学者冈崎（Okazaki）等人提出了DNA的半连续复制（semidiscontinuous replication）模型。在1968年，冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性之后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作为冈崎片段的DNA。延长标记时间之后，冈崎片段可转变为成熟的DNA链，所以这些片段必然是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明DNA复制过程里首先合成较小的片段，即用DNA连接酶温度敏感突变株进行的试验，在连接酶不起作用的温度中，便产生大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程里至少有一条链首先合成较短的片段，之后再由连接酶链成大分子DNA。一般说，原核生物的冈崎片段比真核生物长。深入研究还可证明，前导链的连续复制与滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的半不连续复制。
端粒和端粒酶
在1941年，美籍印度人麦克林托克（Mc Clintock）就提出端粒（telomere)的假说，指出染色体末端必然存在一种特殊结构——端粒。已知染色体端粒的作用至少有2：a.保护染色体末端免受损伤，使染色体保持稳定；b. 与核纤层相连，使染色体得以定位。
弄清楚DNA复制过程之后，在20世纪70年代，科学家对DNA复制时新链5’端的RNA引物被切除之后，空缺为如何被填补的提出了质疑。如果不填补岂不是DNA每复制一次就短一点。后随链复制为例，RNA引物被切除后，冈崎片段之间是由DNA聚合酶I催化合成的DNA填补之，然后再由DNA连接酶将它们连接成了一条完整的链。可是DNA聚合酶I催化合成DNA时，需要自由3’—OH作为其引物，最后余下子链的5’则无法填补，于是染色体就短一点。
在正常体细胞里普遍存在着染色体酶复制一次端粒就短一次的现象。推测，可能一旦端粒缩短至某一阈限长度一下时，就会发出一个警报，指令细胞进入到衰老；或许为当细胞判断出它们的染色体已变得太短了，所以是分裂也就停止了，造成了正常体细胞寿命有一定界限。可是在癌细胞中染色体端粒却一直维持在一定长度上，这是为什么，这是因为DNA复制之后，将染色体末端短缺部分补上需要端粒酶，是一种含有RNA的酶，其既解决了模板，又解决引物的问题。在生殖细胞与85%癌细胞中都测出了端粒酶具有活性，可是在正常体细胞中却无活性，20世纪90年代中期Blackburn首次在原生动物中克隆出端粒酶基因。
端粒酶在癌细胞里具有活性，不仅使癌细胞可以不断分裂增生，且为癌变前的细胞或已经是癌性的细胞提供了时间，积累附加的突变，即等于增加了它们复制，侵入与最终转移的能力。同时人们也由此萌生开发以端粒为靶的药物，即通过抑制癌细胞里端粒酶活性而达到治疗癌症的目的。
至于真核细胞DNA末端结构特点，早就在1978年，Blackburn就以原生动物四膜出（一种纤毛虫）为例说明之：a.迥纹形式的发夹环；b.仅由C,A组成的简单序列大量重复（C4A2）20~70；c.链上有许多缺口（nicks）
