ELISA实验步骤有哪些？
ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA实验步骤及注意事项:
1、固相载体选择
聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。
2、包被
①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。
②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。
③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。
④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。
⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。
3、封闭
①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。
②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。
4、加样及孵育
①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。
③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。
④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。
⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。
5、显色和终止
①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。
②显色底物需现配现用，避免污染。
③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。
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2024-08-28 广告
