Question

干细胞存储后如何进行复苏和检测？

Answer 1

以下是干细胞储存后进行复苏和检测的一般步骤与方法：

干细胞复苏步骤

- 准备工作：
- 提前将水浴锅预热至 37℃左右，这是适宜干细胞快速复苏的温度，能够避免温度过低导致细胞受损，或者温度过高影响细胞活性。
- 准备好合适的细胞培养容器，例如培养皿、培养瓶等，并加入适量的预热至 37℃的完全培养基（含有细胞生长所需的营养成分、生长因子等物质），培养基的量要依据复苏细胞的数量及后续培养需求来确定。
- 准备好无菌的吸管、离心管等实验耗材，以及超净工作台等无菌操作环境，确保整个复苏过程在无菌条件下进行，防止微生物污染影响细胞复苏后的存活与生长。
- 取出冻存细胞：从液氮储存罐中迅速取出装有干细胞的冻存管，操作要尽量快，减少细胞暴露在液氮罐外的常温环境中的时间，因为长时间暴露可能使细胞内形成冰晶，冰晶的形成与融化过程会破坏细胞结构，降低细胞活性。
- 解冻细胞：将取出的冻存管立即放入预热好的 37℃水浴锅中，轻轻晃动冻存管，使管内的细胞悬液能均匀受热，加速解冻过程，一般解冻时间控制在 1 - 2 分钟左右，直至冻存管内的细胞悬液完全融化成液态。
- 转移和洗涤细胞：待细胞悬液融化后，在超净工作台内，用无菌吸管将细胞悬液缓慢转移至提前准备好的离心管中，然后向离心管中加入适量的预热培养基，轻轻混匀，进行低速离心（通常离心机转速设定在 1000 - 1500 转/分钟左右，离心时间 5 - 10 分钟），通过离心使细胞沉淀在管底，去除上清液（含有冷冻保护剂等成分，过多残留可能对细胞产生毒性），再加入适量新鲜的预热培养基重悬细胞，这样就完成了干细胞的基本复苏操作，之后可将细胞转移至合适的培养容器中进行后续培养。

干细胞检测方法

- 细胞活力检测：
- 台盼蓝染色法：将复苏后的干细胞悬液与台盼蓝溶液按照一定比例（如 1:1）混合后，在显微镜下观察，活细胞由于细胞膜完整，不会被台盼蓝染色，而死细胞的细胞膜通透性改变，会被染成蓝色，通过计数未染色的活细胞占总细胞数的比例来评估细胞活力，正常情况下，复苏后细胞活力应达到一定标准（如 70%以上）才算复苏效果较好。
- 代谢活性检测法（如 CCK - 8 法）：把复苏后的干细胞接种到 96 孔板等培养板中培养一定时间后，加入 CCK - 8 试剂，继续孵育，活细胞中的脱氢酶能将 CCK - 8 还原生成有色产物，通过酶标仪检测特定波长下的吸光度值，吸光度值越高代表细胞代谢活性越强、细胞活力越好，以此来判断干细胞复苏后的活性状态。
- 细胞表型检测：利用流式细胞术，选择针对干细胞特异性标志物（不同类型干细胞有其相应的标志物，比如间充质干细胞的 CD73、CD90、CD105 等标志物）的荧光标记抗体，将其与复苏后的干细胞进行孵育结合，然后通过流式细胞仪检测，分析带有相应荧光标记的细胞所占比例，从而确定复苏后干细胞是否维持其应有的细胞表型特征，确保细胞的“身份”及纯度符合要求。
- 细胞功能检测：
- 分化潜能检测：对于具有多向分化潜能的干细胞（如间充质干细胞），可以通过诱导分化实验来检测其功能。例如，将复苏后的干细胞置于特定的诱导分化培养条件下（添加诱导成骨、成脂、成软骨等不同方向分化的诱导剂），培养一段时间后，通过相应的染色方法（如成骨分化后用茜素红染色观察钙结节形成、成脂分化后用 Oil - Red O 染色观察脂滴形成、成软骨分化后用阿利辛蓝染色观察软骨基质形成）或检测相关基因表达等手段，来验证干细胞是否还具备正常的分化能力，以此判断复苏对其功能的影响。
- 旁分泌功能检测：干细胞可分泌多种细胞因子、生长因子等发挥旁分泌作用，通过收集复苏后干细胞的培养上清液，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法检测其中一些关键细胞因子（如血管内皮生长因子、转化生长因子等）的含量，评估干细胞的旁分泌功能是否正常，进而推断其功能状态。

干细胞的复苏和检测需要严格遵循无菌操作规范以及相关的实验技术标准，确保复苏后的干细胞能有效应用于后续的科研、临床等相关领域。不同类型的干细胞以及不同的应用场景，在具体操作细节和检测指标要求上可能会稍有差异。