Question

我在上海美吉生物进行龙虾转录组高通量454测序，美吉公司要求我构建cDNA文库时去POLY-A，请问为什么？

Answer 1

454测序技术用的是焦磷酸方法，焦磷酸测序技术原理如下：

一、1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。

二、向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

三、在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

四、反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

五、加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

从焦磷酸测序原理可以看出，测序仪是根据加入碱基后可见光信号的有无判断是何种碱基，通过强弱来判断碱基的数量。当测序样品中存在某一连续碱基（如PolyA等）的情况时，信号强度会特别强，CCD无法识别具体有几个碱基，会造成错读。另外454测序板上的孔与孔之间距离很近，信号过强的话会影响临近孔的信号，形成所谓“鬼影子”。所以454测序一定要去除Poly结构。

Answer 2

直接咨询该公司技术人员。

Answer 3

楼上正解，我也在他们那里做过，你有问题其实可以直接问他们的，他们会很认真的给你解释清楚。