绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用
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绿色萤光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现.其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光.这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用.
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置.由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点.
在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene).一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法.
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.
GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等.
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能.GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生李滚蚂、发展中的作用及其分子机制提供便利条件.
在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体.若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡.肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控.用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因.
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常.利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制.
1994年,华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP,有多项发现.世界上用备镇的大多数是钱永健实验室改造后的变种,有的荧光更强,有的黄色、蓝色,有的可激活、可变色.到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好,现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮.不过真发现的有用东西并不很多.成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白,包括红色荧光蛋白.
生物发光现象,下村修和约翰森以前就有人研究.萤火虫发荧光,是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin）,有化学反应如氧化,以后产生荧光.而蛋白质本身发光,无需底物,起源是下哪埋村修和约翰森的研究.
下村修和约翰森用过几种实验动物,和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母.1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道,他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素.据说下村修用水母提取发光蛋白时,有天下班要回家了,他把产物倒进水池里,临出门前关灯后,依依不舍地回头看了一眼水池,结果见水池闪闪发光.因为水池也接受养鱼缸的水,他怀疑是鱼缸成分影响水母素,不久他就确定钙离子增强水母素发光.1963年,他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系.其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度,创造了检测钙的新方法.钙离子是生物体内的重要信号分子,水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法,是目前仍用的方法之一.
1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光,但不知其因.在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中,有个注脚,说还发现了另一种蛋白,它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色.其后他们仔细研究了其发光特性.1974年,他们纯化到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP.Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移.水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光.这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现.
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣,也没有意识到应用的重要性.他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后,同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子.1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）.1992年,普腊石拿到了GFP的基因.有了cDNA,一般生物学研究者就很好应用,比用蛋白质方便多了.
普腊石1992年发表GFP的cDNA后,不做科学研究了.他申请美国国家科学基金时,评审者说没有蛋白质发光的先例,就是他找到了,也没什么价值.一气之下,他离开学术界去麻省空军国民卫队基地,给农业部动植物服务部工作.当时他如果花几美元,就可以做一个一般研究生都能做,但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内,比如细菌里,看到荧光,就完全证明GFP本身可以发光,无需其它底物或者辅助分子.
将GFP表达到其它生物体这项工作,1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室,和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji.
水母素和GFP都有重要的应用.但水母素仍是荧光酶的一种,它需要荧光素.而GFP蛋白质本身发光,在原理上有重大突破.
Chalfie的文章立即引起轰动,很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统.在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章,其实不过是跟风性质,没有原创性.
纵观整个过程,从1961年到1974年,下村修和约翰森的研究遥遥领先,而很少人注意.如果其他生化学家愿意,他们也可以得到水母素和GFP,技术并不特别难.在1974年以后,特别是八十年代后,后继的工作,很多研究生都很容易做.其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色,并非显而易见.
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置.由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点.
在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene).一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法.
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.
GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等.
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能.GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生李滚蚂、发展中的作用及其分子机制提供便利条件.
在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体.若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡.肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控.用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因.
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常.利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制.
1994年,华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP,有多项发现.世界上用备镇的大多数是钱永健实验室改造后的变种,有的荧光更强,有的黄色、蓝色,有的可激活、可变色.到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好,现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮.不过真发现的有用东西并不很多.成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白,包括红色荧光蛋白.
生物发光现象,下村修和约翰森以前就有人研究.萤火虫发荧光,是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin）,有化学反应如氧化,以后产生荧光.而蛋白质本身发光,无需底物,起源是下哪埋村修和约翰森的研究.
下村修和约翰森用过几种实验动物,和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母.1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道,他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素.据说下村修用水母提取发光蛋白时,有天下班要回家了,他把产物倒进水池里,临出门前关灯后,依依不舍地回头看了一眼水池,结果见水池闪闪发光.因为水池也接受养鱼缸的水,他怀疑是鱼缸成分影响水母素,不久他就确定钙离子增强水母素发光.1963年,他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系.其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度,创造了检测钙的新方法.钙离子是生物体内的重要信号分子,水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法,是目前仍用的方法之一.
1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光,但不知其因.在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中,有个注脚,说还发现了另一种蛋白,它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色.其后他们仔细研究了其发光特性.1974年,他们纯化到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP.Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移.水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光.这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现.
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣,也没有意识到应用的重要性.他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后,同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子.1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）.1992年,普腊石拿到了GFP的基因.有了cDNA,一般生物学研究者就很好应用,比用蛋白质方便多了.
普腊石1992年发表GFP的cDNA后,不做科学研究了.他申请美国国家科学基金时,评审者说没有蛋白质发光的先例,就是他找到了,也没什么价值.一气之下,他离开学术界去麻省空军国民卫队基地,给农业部动植物服务部工作.当时他如果花几美元,就可以做一个一般研究生都能做,但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内,比如细菌里,看到荧光,就完全证明GFP本身可以发光,无需其它底物或者辅助分子.
将GFP表达到其它生物体这项工作,1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室,和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji.
水母素和GFP都有重要的应用.但水母素仍是荧光酶的一种,它需要荧光素.而GFP蛋白质本身发光,在原理上有重大突破.
Chalfie的文章立即引起轰动,很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统.在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章,其实不过是跟风性质,没有原创性.
纵观整个过程,从1961年到1974年,下村修和约翰森的研究遥遥领先,而很少人注意.如果其他生化学家愿意,他们也可以得到水母素和GFP,技术并不特别难.在1974年以后,特别是八十年代后,后继的工作,很多研究生都很容易做.其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色,并非显而易见.
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