做ELISA实验需要注意一些什么？
2018-06-26 · 专注各类elisa试剂盒、血清抗体
南京金益柏生物科技有限公司
Elisa实验中应该注意的问题,包括样品稀释、试剂盒平衡、样品和试剂的混匀、加样、温育等问题,希望对你有用处.
Elisa试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强的诸多优点,深受广大用户朋友的喜爱.然而,在实验过程中,也需要注意很多问题.对此,武汉福来生物工程提醒你,需要遵守一些规则,才能更好地进行实验,取得较好的实验成果.
Elisa方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定.在Elisa测定中影响因素较多,在检测过程中除正常反应外,有时常见到一些错误的结果.引起ELISA测定错误结果的原因主要有：标本因素；试剂因素；操作因素.
1．样品稀释
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定,以保证试验的灵敏度和特异性.酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应,如果血清不稀释,不可避免会产生很强的非特异性反应,出现假阳性.
2．试剂盒平衡
Elisa中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃),一般需在室温放置20～30分钟以上.平衡时间太短会造成试剂混匀不够,样品孵育时间相对缩短,ELISA反应不够充分.冬季室温低,可将试剂盒置37℃温箱20分钟.
3．样品和试剂的混匀
在稀释前、后的样品必须充分混匀,所有试剂在加样前也须摇匀,以保证试验的均一性.
4．加样
加样是一项很重要的步骤.加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡.加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性.加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附.
5．温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素.ELISA作为一种固相免疫测定,抗原抗体的结合反应在固相上进行,要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合,必须在一定的温度条件下反应一定的时间.
6．洗板
固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术,需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来,以保证ELISA测定的特异性.洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及时更换吸水纸,尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去,否则可能影响试验结果.
7．显色
显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可.一般来说,显色时间过短,结果偏低；显色时间过长,空白增高或者非特异性显色增加.
8．比色
比色要注意波长的选择.以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用,而前者比色波长为450nm,后者为492nm,滤光片需根据要求随时更换.因此,容易出现滤光片错用的问题.
2、吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。
4、实验时，要使底物避光保存。
5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。
6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。
7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触。
8、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。
9、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。
10、底物是光敏感的，要在临用前现配。
11、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。
12、待检样品要澄清，否则会影响结果。
13、温浴时间应遵守试剂盒规定。
14、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。
15、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。
用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆）。本实验室用ELISA测定乙肝两对半，甲肝，戊肝，抗HIV的标本时，在处理和保存方面要考虑以下几个方面： 1） 要注意避免出现严重溶血及血清中混有红细胞。当标本出现严重溶血及血清中混有红细胞时，反应孔不易洗净，残留在反应孔内的血红蛋白具有过氧化物酶的活性，显色时可能造成假阳性。 2） 标本凝固不全强行离心，造成血清中含有少量的纤维蛋白原，在实验过程中形成纤维蛋白吸附在反应孔孔壁上不易洗掉，易造成假性结果。 3） 血清标本可在2～8℃下保存1周。如血清样本需长时间保存，则需放入-20℃冰柜内冰冻保存。冰冻保存的血清标本须注意避免反复冻融，标本可能引起假阴性结果。此外冻融标本的混匀不要进行剧烈振荡，应反复颠倒混匀。
2 ELISA 测定中试剂准备
在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再 进行测定，证试剂盒温度要和室温一致。如果把试剂盒从冰箱拿出来直接做实验会造成一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因为在后面的孵育反应步骤中，造成孵育时间不够。其次，ELISA实验中洗板用的洗液需每日更换配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
3 加血清样本及反应试剂
血清样本使用微量加样枪加样。使用微量加样枪加样必须注意避免以下几点： 1） 加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。需匀速加样，吸样时，加样枪需按到第一档，加样时，加样枪需直接按到底。 2） 加样应直接加入反应孔底部，加在反应孔孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡。 3） 反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易出现重复滴加或加在两孔之间.
4 温育的时间与温度
温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点： 1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够，弱阳性样本测不出来 。 2）因为采用水浴，所以在温育时一定要封板，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，并有可能整板花板。
5 ELISA测定的洗板
全自动洗板机的使用应注意以下几点： 1） 洗板前，应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶。2） 在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅。 3） 在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。
6 ELISA测定以TMB为底物的显色
加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效期。滴入A、B显色剂后，需温育15min，最后加入终止液终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定判断结果。在此过程中应注意不要把显色剂和终止液滴入顺序弄反，否则重做实验。
7 ELISA的比色测定
ELISA的比色测定由酶标仪进行测定，故需强调比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否是双波长（450nm和630nm）。
8 ELISA测定结果判定
结果判定一般是根据比色结果和肉眼观察综合判定。如在判定过程发现有些反应孔出现倒阴不阳的现象或出现不常见的模式（如乙肝两对半中出现12阳性等），需本着严谨的态度，重新复查。
对ELISA测定中出现问题的可能原因（非试剂盒本身的原因），总结如下： 1)弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。
2）测定的重复性差 ，这是由于测定操作引起的问题，包括 ①加样本及试剂量不准；孔间不一致 ②加样过快，孔间发生污染 ③加错样本 ④加样本及试剂时，加在孔壁 ⑤不同批号试剂盒中组分混用 ⑥温育时间、洗板、显色时间不一致 ⑦孔内污染杂物，血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性等。 3）全部孔都不显色 ① 漏加酶结合物； ② 洗板液配制中出现问题 ③ 漏加显色剂A或B ④ 终止剂当显色剂使用 4）全部板孔均有显色 ① 板不干净 ② 显色液变质 ③ 洗板液受酶等污染
原理：将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体（常用聚苯乙烯，对蛋白质有较强物理吸附性能，且不影响抗体和抗原的免疫活性）上，并保持其免疫活性。测定时，将待测样和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，洗涤分离抗原抗体复合物和游离成分；最后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高敏感度。
样品不立即使用时，应将其分成数管-20℃或-80 ℃保存，避免反复冷冻。因ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性，-20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测，4℃保存的样本在一周内完成检测。
