Question

Western Blot为什么必须要用内参

Answer 1

Western Blot
为什么必须要用内参

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是
Western Blot
。
因为
Western
Blot
操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相
对变化。虽然，顺利的时候
Western
Blot
做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结
果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有
活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象
1+1
那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样
知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的
Western
Blot
实验设计中要求有
良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就
可以查出问题所在，
而不必抓耳挠腮怨天尤人。
良好的参照体系通常包括
分子量
Marker
（用来确定
蛋白条带对应的分子量大小）
，空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）
，
已知
量标准产物的正对照
；
另外还有
内参
。
可是由于经费限制或者偷懒的原因，
国内的不少人做
Western
Blot
往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用
Western
Blot
比较不同条件下或者不同组织中，目的
蛋白表达量的相对多少，
前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础
。特别表达量不高时，上样
量误差就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参
即是内部参照（
Internal
Control
）
，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由
管家基因编码表达的
蛋白
(Housekeeping
Proteins)
，它们
在各组织和细胞中的表达相对恒定
，在检测蛋白的表达水平变化
时常用它来做参照物。在
Western
Blot
实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样
电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，
还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上
样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性
。

在国外发表的文章中，
Western
Blot
实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不
少科研人员在
Western
Blot
实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种
样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确
定各种样品的准确蛋白浓度。如
UV
法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对
于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如
DNA
的干扰；且敏感度低，要求蛋白
的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有
BCA
，
Bradford
，
Lowry
等几种方法。
BCA
法与
Lowry
法
都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford
法敏感度最高，
且与一系列干扰
Lowry
，
BCA
反
应的还原剂（如
DTT
，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的
标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上
样，此步骤也存在操作误差。
在
Western Blot
实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生
的误差进行校正。