Question

说明利用接合测定微生物学大肠杆菌+DNA+序列的原理

Answer 1

问：说明利用接合测定微生物学大肠杆菌+DNA+序列的原理

答：DNA测序的测序原理是：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

答：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图7-4-1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。