Question

大肠杆菌培养及计数

在对培养的大肠杆菌进行活菌计数时，发现琼脂表面有乳白色微偏暗的直径约4~5mm的菌落，琼脂底部与培养皿接触的面上有浅色较浅的白色直径约3mm的菌落，而琼脂内的菌落却只有约1mm直径，请问琼脂内的菌落是大肠杆菌菌落吗？会不会是杂菌？如果是大肠杆菌，为什么一个平皿内的相同菌会形态不一样？

注：1.试验环境为无菌环境，操作均严格按照无菌操作进行。

2.培养的过程：冻干菌株——复苏——营养肉汤培养（37摄氏度摇床，约18小时）——营养肉汁琼脂培养基平皿画线培养（37摄氏度隔水恒温培养箱，约24小时）——（挑取单个菌落）营养肉汁琼脂斜面培养基培养（37摄氏度隔水恒温培养箱，约24小时）——活菌计数实验（培养：37摄氏度隔水恒温培养箱，约48小时）
补充：实验是在专门的无菌室的无菌操作台做的，所有器材、试剂、培养基等也都已经过高压灭菌。
活菌计数所使用的是用稀释液从前面的斜面培养基上洗下的菌悬液。菌悬液经稀释至10的-8次方后选择了-6、-7、-8三个稀释度的悬液各1ml，分别倒入平皿中，而后倒入40~45摄氏度的营养肉汁琼脂，混匀，放入37摄氏度的培养箱中培养48小时。现发现，培养基表面、底面、内部的菌落形态不一样，我怀疑是有杂菌，而后对怀疑有菌的培养基、稀释液等都分别作了培养，并且重新用冻存珠重复了一次培养及计数的过程，仍没有找出原因

Answer 1

从你的培养过程看；其中一个环节不知道你做了没有？培养基配制好后倒平板之前是否进行了灭菌？假如这步你没有做那么出现杂菌就是必然的，其琼脂内有杂菌也就是这个原因造成的。
琼脂底部与培养皿接触的面上有浅色较浅的白色直径约3mm的菌落。。这个问题是不是因为你的培养皿灭菌不彻底造成的。
你说的同一平板内同一菌种的形态却不一致，这个很可能是接种过后你的培养基被污染了，所以还是混了杂菌。还有一个原因就是你挑去的单菌落并不是纯的单菌落，它自身就含杂菌。
我的回答只能作为参考，希望对你有用。也希望你下次试验能成功。

Answer 2

如果楼主在做活菌计数实验中，使用的是制作菌悬液，然后在制备好的平板上，做稀释涂布计数并严格按照无菌操作进行的话，上述楼主说提到的问题中，根本不会有菌落出现在平板底部和中部，如果是平板表面出现菌落大小不一的情况这个是很正常的，每一个菌落由单一细胞生成，但是起生长繁殖速度当然是有区别的了。