Question

分子生物学问答题总结

7、真核翻译后水平的调控有哪些 （1）翻译后产生的多数蛋白质无生物活性，必须经过切割加工、水解、化学修饰、剪接; （2）某些蛋白质有选择的受到抑制; （3）某些蛋白质必须位于细胞内特定位置，如溶酶体、线粒体、叶绿体; （4）需同其他蛋白质结合，组装成功能单位，如血红蛋白、微管蛋白、核糖体等，都是由多条蛋白质分子结合在一起形成的功能单位。 1. Sanger 的双脱氧链终止法基本原理？ 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序

Answer 1

1．DNA是遗传物质的两个重要试验的主要步骤？
答：（1）Griffith及Avery细菌发生遗传转化试验证明了
DNA是病毒的遗传物质，其具体步骤为：首先用活S型
肺炎链球菌感染小鼠，小鼠死亡，而活R型感染，小鼠不死
接着用灭活的S型和R型感染小鼠，结果都不致死；
但是用灭活的S型和活R型混合感染小鼠，小鼠死亡，解剖
小鼠发现有活的S型致病菌，分离死S型细菌各组分与活
R型混合感染小鼠，发现
只有S型DNA能使R型
细菌发生转化，获得致病力，此实验证明DNA就是遗传物质。
（2）Hershey用噬菌体感染细菌的试验证明DNA
是细菌的遗传物质。其具体步骤为：在含有放射性标记的
35S和32P的氨基酸或核苷酸培养液中培养噬菌体，获得含
放射性标记的噬菌体，用
这些放射性噬菌体感染无放射性大肠杆菌，经过1-2次传代
后，子代噬菌体中几乎
不含带35S标记的蛋白质，但还有30%的32P标记说明在
传代过程中发挥作用的是DNA而不是蛋白质。
2、简述中心法则的主要内容？
(1) DNA序列是遗传信息的贮存者，通过自主复制得到永存
；(2) DNA通过转录生成RNA;
(3) 含遗传信息的mRNA通过翻译生成蛋白质来控制生命
现象；(4) 同时某些RNA可以通过逆转录将遗传信息传到
DNA；(5) 某些RNA自身
还可进行复制使其遗传信息得以永存。
1、 原核和真核生物在基因组DNA结构上有哪些差异？
原核：（1）基因组较小，环状双螺旋DNA与DNA结合
蛋白结合成带有单拷贝基因的单染色体（2结构简练几乎
全部由功能基因和
调控序列组成，几乎每个基因序列都与其所编码的蛋白质呈
4）有些原核生物基因组内存在基因重叠现象，但编码序列
一般不重叠。（5
）基因是连续的，没有内含子。
真核：（1）线性DNA与组蛋白结合形成染色体形式
一般有多条。（2） 数量庞大含有大量重复序列（3）
基因组中多数为非编码序列
（4含有割裂基因 （5具有多态性（6转录产物为单顺
反子 （5）具有端粒结构
2、作为遗传物质应该具备哪些特性？为什么说DNA适合
作为遗传物质？
遗传物质特性：贮存并表达遗传信息，能把信息传递给
子代，物理和化学性质稳定，具有遗传变化的能力
DNA特性：各异的碱基序列储存大量的遗传信息，DNA
的复制是其表达和传递遗传信息的基础，通过磷酸二酯键
相连，形成双螺旋结构，生理状态下物理、化学性质稳定，
有突变和修复能力，
可稳定遗传是生物进化的基础。
3、简述DNA双螺旋结构的主要特点
双链反向平行，具有5‘-3’极性，围绕中轴，螺旋盘旋，
磷酸，脱氧核糖为骨架，以磷酸酯键相连，位于外侧，
碱基互补配对，以氢键相连，位于内侧，大沟，小沟交替
出现。
4、简述真核染色体的组装过程
DNA链盘绕由H2A,H2B，H3,H4组成的组蛋白八聚体核心
形成念珠状结构的核小体，两端由H1封阻。核小体之间
以DNA链连接，形成10nm纤丝状结构，螺旋后形成30nm
螺纹管结构，折叠盘绕形成染色体。
5、影响DNA稳定性的因素有哪些
氢键，磷酸酯键，0.2 M Na+ 生理盐条件，碱基堆积力
(范德华力) ，疏水作用力
6、请问哪些条件可促使DNA复性(退火)
降低温度、pH值和增加盐浓度可以促进DNA复性(退火)
7、影响Tm的因素有哪些
（1）在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量，
GC含量越高，Tm越大
（2）GC%含量相同的情况下， AT形成变性核心，变性
加快，Tm 值小
（3）对于大片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列
相关
（4）对于小片段，片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小
（5）变性液中含有尿素，甲酰胺等可降低Tm
（6）盐浓度和PH值也会影响Tm
1、简述原核和真核DNA复制的特点？
（1）原核为单复制起点，真核为多复制起点（2）原核
复制子大而少，真核复制子小而多（3）真核复制起始受许可
因子的控制 （4）
真核复制叉移动的速度快，原核速度慢（5）真核冈崎片段
小，原核大（6）真核复制存在端粒和端粒酶（7）真核原核
DNA聚合酶种类，结构，
作用上有差异（8）真核生物DNA复制的起始需要起始原点
识别复合物（ORC）参与
2、线性DNA如何解决末端复制的问题？
（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。（2）某种
蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。（3）DNA可
形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端
。（4）末端是可变的，而不是精确确定的。
3、列举参与DNA复制过程中的主要酶及其功能
解旋酶：解开双螺旋，推动复制叉向前延伸
SSB：使DNA单链保持一种伸展 构象，作为模板；使解开
的单链不形成发卡结构；保护DNA单链不受Dnase水解
螺旋酶：消除正超堆积，减少能量需求，有利于DNA解链
引物酶：合成的引物，减少致死突变。
DNA连接酶：催化双链DNA上的单链断点的5’-与3’-生成
磷酸二酯键，封闭DNA双链断点
DNA聚合酶：聚合作用 ，3’→5’外切酶活性（校对作用）
，5’→3’外切酶活性（切除修复作用）
4、请以原核生物为例，说明DNA复制的过程
起始蛋白复合体与DNA链复制起始点结合，在解旋酶和单链
结合蛋白作用下解旋，启动复制起始
起始形成的复制引发体在后随链上合成多个RNA引物，DNA
聚合酶以核苷酸为底物延伸前导链和后随链。后随链合成的
不连续冈崎片段用
DNA连接酶连接
复制到达复制终止序列，在终止蛋白作用下终止复制。
5、DNA复制过程中如何保证其遗传信息传递的忠实性？
（1）碱基配对原则（2）DNApol的3’?5’外切酶活性（校正
） （3）DNApol只能从引物的3’ 端延伸DNA（切除），
需要RNA引物，而RNA引物最终被降解而避免错误（4）
半不连续机制，有利于错配碱基的校正（5）修复系统有多种
机制和酶
6、DNA连接酶对于DNA的复制是很重要的，但RNA的
合成一般却不需要连接酶。解释这个现象的原因
在DNA复制时，连接酶对于后随链的合成是重要的，因为
它能将冈崎片段的5’端与它前面的另一条链的3’端连接起
来。RNA的合成既能以
DNA为模板(RNA聚 合酶活性)，又能以RNA为模板(
RNA复制酶活性)；相应的，先导链的合成沿着5’→3’
方向进行，不需要连接酶。
7、解释在DNA复制过程中，后随链是怎样合成的
因为DNA聚合酶只能朝着5’→3’的方向合成DNA，
后随链不能象前导链那样总是朝着同一方向合成，滞后链是
以大量独立
片段的形式(冈崎片段)合成的，每个片段都是以5’→3’方向
合成，这些片段最后连在一起形成一连续的多核苷酸链。
每个片段都独立地被引发，聚合和连接
1、列出真核生物mRNA与原核生物mRNA的区别：
原核生物mRNA的半衰期短，多以多顺反子形式存在，5′
端无帽子结构，3′端没有或有较短的polyA尾巴。单在
原核生物起始密码上游具有
能与核糖体16SrRNA3′端反向互补的序列，称SD序列
。原核生物mRNA的起始密码子有AUG、GUG和UUG三种
。转录和翻译在同一区域进行
真核生物mRNA半衰期相对较长，多以单顺反子形式存在
，5′端有GTP倒扣形成的帽子结构，3′端有较长的polyA
尾巴。只有AUG一种起始密码子。转录在核内而翻译在核外
进行。
2、概括说明σ因子对启动子调节的辅助功能。
σ因子是RNA聚合酶的别构效应物，能增加聚合酶对启动子
的亲和力，同时降低聚合酶对非启动子区的亲和力。由于
同一个聚合酶可以和几种不同σ因子结合，故可利用选择不同的σ因子起始不同的基因转录。
3、列举原核生物同真核生物转录的差异？
（1） 原核生物转录只有一种RNA聚合酶，真核生物转录
根据转录产物不同而由多种RNA聚合酶。（2） 原核生物的
启动子具有极高的同源性，而真核生物的启动子差异较大
（3）原核生物的转录
产物是多顺反子mRNA，而真核生物的转录产物是核不均一
RNA，需转录后修饰加工。
4、概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是
保守序列？
启动子是RNA聚合酶结合和转录起始的特殊序列。典型的
原核生物启动子大约40个核苷酸，并由两个重要的序列：
－10区，pribnow box，TATA，和－35区TTGACA，是RNA
聚合酶的结合位点。保守序列指所有启动子的该部位都有
这一序列或十分相似的结构。
5、真核生物启动子的基本结构包括哪些部分？分别有何功能？
真核生物启动子包含核心启动子元件和上游启动子元件
两部分。核心启动子元件即TATA box，其功能是使转录
精确的起始。上游启动子元件包括CAAT box 和GC box，
其功能是控制转录起始的频率。
6、增强子是如何增强转录的？
通过影响染色质DNA－蛋白质结构或改变超螺旋密度而
改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与模板
DAN结合，起始基因转录。
7、添加PolyA尾巴的信号序列是什么？简述尾巴结构的
生理意义
基因3′末端转录终止位点上游15～30bp处的保守序列
AATAAA
生理意义：保持mRNA的稳定性，防止被降解；与翻译
起始有关
8、简述转录的常规特点
（1）在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转录（2）
A＝U、C≡G 合成RNA分子
（3） 转录合成RNA链的方向为5’→3’，模板单链DNA的
极性（4）方向为3’→5’， 而非模板单链的极性方向与RNA
链相同，均为5’→3’。
书写） （5）基因转录方式为不对称转录(一条单链DNA 为
模板,RNA聚合酶的结合)
9、RNA酶促合成的基本特征
(1) 双链DNA分子以单链为模板；(2) 不需引物；(3) 底物
是5`-核苷三磷酸（NTP）；
(4) 前一个碱基的 3`-OH和后一个碱基的 5`-P反应，形成
磷酸二酯键，RNA链延伸；
(5) RNA碱基顺序由模板DNA顺序决定； (6) RNA合成方向
是从5`→3`，新生RNA与模板DNA链呈反向平行；
9、简述ρ因子依赖性终止子的作用机理
ρ因子结合：最初结合到RNA终止子上游一个伸展的
（约70个核苷酸）单链区。
ρ因子移动：结合到RNA上后，发挥ATP酶活性以提供
在RNA上滑动的能量，直到它到达RNA-DNA杂合链区域
(可能ρ因子沿RNA移动比聚合酶沿DNA移动的速度快)，
终止：ρ因子发挥解旋酶活性，使双链体结构
10、比较真核生物与原核生物转录起始的第一步有什么不同
细菌中，DNA指导的RNA聚合酶核心酶由四个亚基组成
(两个α亚基，一个β亚基，一个β’亚基)，核心酶与σ亚基
结合产生全酶。核心酶可以催化NTP的聚合，但只有全酶能
够引发转录的开始。主要的步骤是：具有特异识别能力的。亚
基识别转录起，始点
、上游的启动子特异同源序列，这样可以使全酶与启动子序列
结合力增加，形成封闭的二元复合物。关键的作用是RNA
聚合酶与DNA的相互
作用。真核生物中，当含TBP的转录因子与DNA相互作用时
，其他因子也结合上来，形成起始复合体，这一复合体再与
RNA聚合酶结合，因此
主要是RNA聚合酶与蛋白质之间的作用。
11、 转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链
DNA是怎样被保护的
转录过程中控板与编码链分离时，聚合酶覆盖了整个转录泡—
—从解旋位点到螺旋重新形成位点，因此单链的DNA被
保护起来。与复制不同，
转录不需要单链结合蛋白的参与。
12、 概括说明σ因子对启动子调节的辅助功能
σ因子(除了RpoN)有识别启动子序列的结构域。作为游离的
蛋白质；σ因子并不具备与DNA结合的构象。当σ因子与
核心酶结合后构象发生改变，其N末端游离出与DNA结合
的结构域。σ因子的这一调节方式是为了防止游离的σ因子
与启动子区结合，
而阻碍了依赖于全酶的转录启动。另外，这样也可防止形成
全酶的σ因子的浓度被稀释，因为每一个细胞中，大约每三个
核心酶对应于一个σ因子。
13、为什么只有DNA双螺旋中的一条链能被正常的转录?
如果两条链都被转录，每个基因就能编码两个不同的多肽
14、原核生物的核糖体RNA和DNA相对较稳定并且半衰期
而mRNA却不稳定很快被降解请解释这种稳定性的差异
如果转录物的寿命很长，就不可能通过控制mRNA的合成
速率来调节基因的活性。另一方面，如果tRNA和rRNA的
寿命长的话，就更合算。
15、启动子有何作用特点
（1）一个基因可同时拥有一个及以上启动子 （2）启动子
位置不定，一般在转录起始点上游。 （3）可与增强子共同
控制转录起始和强度。 （4）发挥功能时除需RNA聚合酶外
，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用
16、增强子有何作用特点
① 可增强效应十分显著； ② 增强效应与其位置和取向无关； ③ 大多为重复序列；
④ 一般具有组织或细胞特异性； ⑤ 无基因专一性； ⑥ 许
多增强子还受外部信号的调控
17、如何通过实验确定启动子与增强子边界及关键序列元件
边界序列确定:从一段特定的含有启动子的DNA片段入手，
从DNA的两侧不断缩短长度直至短到停止产生活性的某一
位置。
保守序列确定：A: 对已知启动子序列，可通过缺失或突变确
定哪些碱基为必需；
B: 还可通过比较不同的启动子间的同源性，
确定哪些序列为保守序列。
18、回答大肠杆菌RNA聚合酶各亚基生物学功能
β和β’共同组成了酶的催化中心。它们的序列与真核生物
RNA聚合酶的最大亚基相关。
β亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。
β’亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。α亚基的功能
可能是识别其相应的启动子。原核生物σ因子的功能：帮助
核心酶辨认启动子；解开DNA的双螺旋
I型内含子发生改变后，可以产生其他酶的活性吗?如果可以
，是哪些活性?这意味着I型内含子的催化中心有什么特点？
可以。这些活性包括：RNA聚合酶、内切核酸酶、磷酸酶、
连接酶的活性将I 型内含子转变成这些酶的能力表明它能
结合于RNA的糖—磷酸骨架并能催化在它前后的几个不同
反应。例如，连接是剪切的相反反应
1、列举核糖体上主要的活性位点，并解释起功能
(1)mRNA结合位点—30S头部：防止mRNA链内碱基结合，
促进mRNA与小亚基结合
(2)肽酰－tRNA位点—P位点：结合起始rRNA，增强A位
活性
(3)氨酰基 tRNA 位点—A位点：结合特定氨酰tRNA
(4)脱酰基tRNA和多肽的逐出位点—E位点：E1为脱酰基
tRNA 离开核糖体提供出口；E2对蛋白质合成的准确性起
重要作用；E3为多肽离开核糖体提供出口
其他位点：结合起始，延伸等因子
(5)5s rRNA位点（与tRNA进入有关）;(6)EF—Tu（延伸因子
）位点 ：位于大亚基内，与氨酰基 tRNA的结合有关;(7)
EF—G :转位因子结合位点,位于大亚基靠近小亚基的界面处
2、简述蛋白质生物合成的基本过程
1）起始：核糖体小亚基识别起始位点，在起始因子作用下
，与大亚基，氨酰tRNA结合，形成起始复合物 2）延伸：
核糖体在mRNA移动，在延伸因子作用下，通过转移肽酰
tRNA到氨酰tRNA，即经过进位，肽键形成
和转移，脱落，移位的循环至终止密码子完成肽链延伸
3）终止：在释放因子作用下，识别终止密码子，肽链从
tRNA上释放，核糖体离开mRNA
3、什么是摇摆假说?
在蛋白质生物合成中转移核糖核酸反密码子的5′位碱基
不严格的特异性的假说。允许反密码子的5′位(第一位)
碱基与信使核糖核酸的密码子3′位(第三位)碱基通过改变
了的氢键配对(如非G-C、A-U 配对)，从而识别一种以上的
密码子
4、指出E.coli和真核生物翻译起始的不同
[1]翻译的起始识别
原核的起始tRNA是fMet-tRNA，存在SD序列和核糖体
结合序列作为翻译起始位点，真核生物利用eIF4不同结合
位点结合帽子和尾巴结构，识别起点。
[2]翻译起始：原核生物30s小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNA结合，最后与50s大亚基结合。真核中起始tRNA是
Met-tRNA，40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合，再与模板mRNA结合，
最后与60s大亚基结合生成起始复合物，且真核生物的起始因子较多。
5、 N-甲酰甲硫氨酸-tRNA的功能是什么?
作为起始氨酰tRNA，能够识别AUG和GUG作为起始密码子，与IF-2结合成复合体进入小亚基的P位点
6、解释核糖体肽基转移反应
肽基转移酶的活性区位于大亚基，临近肽酰tRNA的氨基酸茎，核糖体P位点和A位点。50S上肽酰转移酶催化P位的肽（氨）酰-tRNA把肽（
或氨酰基）转给A位的AA-tRNA，并以肽键相连的过程
7、简述真核细胞中翻译终止的过程
由于氨酰tRNA上没有反密码子能够与三个终止密码子互补
配对，因此翻译终止。终止需要tRNA的协助，此时没有氨基酸能够连接到位于P位点的肽酰tRNA上，释放因子有助于终止的发生，能使tRNA上的氨基酸C端不需要
转肽基和脱酰基而发生转位。新生肽直接从P位点离开核糖体。
8、真核与原核核糖体的主要区别是什么?
真核细胞80S核糖体中核糖体蛋白和rRNA数量和体积比原核细胞70S核糖体的大，真核大小亚基（40S和60S）均比原核细胞的大（30S，50S）。原核细胞的RNA含量比真核高，原核细胞核糖体有E位点便于脱酰tRNA的离开。原核中多以多聚核糖体形式存在，真核大多与细胞骨架和内质网膜结合
10、密码子具有哪些特性
（1）连续性：肽链合成起始后，密码子按3个一框读下去不重叠也不跳格，直到终止
(2)简并性：许多氨基酸对应的密码子不止一种
(3)兼职性：AUG（Met)和GUG（Val)两个密码子除代表特定氨基酸外，还兼作起始密码子
(4)普遍性：各物种体内体外都适用
(5)密码子-反密码子识别的摇摆性：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，而第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。
简述信号肽作用机制
信号肽便被信号识别颗粒(SRP)识别，SRP与携带新生链的核糖体结合而停止翻译
SRP再与内质网上的船坞蛋白(DP)结合翻译阻滞逆转，并使正在延伸的肽链转移到内质网腔内，信号肽被切除。
新生肽进入ER腔之后经折叠，修饰（糖基化和羟基化等）后运送到其它的部位。
1、酵母双杂交系统原理
不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能 ，酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用
2、酵母单杂交原理
将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。
3、简述DNA重组的基本过程？
（1）目的基因的提取：供体生物基因或称外源基因的提取
（2）限制性酶切：目的基因切成不同大小片段
（3）酶接：连接到另一DNA分子上-克隆载体
（4）转化：重组DNA分子转入受体细胞
（5）筛选和鉴定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定
（6）基因表达：进行培养，检测外源基因是否表达
4、凝胶电泳的工作原理与应用
原理：1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移；
2）电泳中使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子大小、介质粘度等成反比；
因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。
应用：分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，分子克隆技术核心技术
5、分子杂交的试验流程以及分类
样品及探针制备--样品电泳分离---转膜----预杂交-----杂交----洗膜----分析（压片、显色、荧光观察等）
分类： Southern blot ， Northern blot，Western blot，ISH， FISH
6、简述DNA足迹试验的原理与应用 DNA结合蛋白结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带 7、简述凝胶阻滞试验的原理 原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将增加，在电泳中移动的速率减小，没有结合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这一原理可分离纯化细胞提取物中特定DNA结合蛋白 8、简述PCR的工作流程，原理与应用 原理：利用DNA复制的半保留复制和DNA变性与复性的特性，用特异性引物对模板DNA进行指数扩增。 流程：首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是这种循环的不断重复。使DNA扩增量呈指数上升。 应用：基因组中特异片段克隆，不对称PCR，反向PCR，基因的体外诱变，RT-PCR，免疫PCR，基因组的比较研究 9、基因克隆的主要载体有哪些？ 质粒载体，噬菌体载体， BAC，克隆载体，表达载体，YAC，粘粒等 10、作为表达载体应具备哪些特点？ （1）能自主复制；（2）具有一个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； （4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 11、作为DNA重组应用较多的限制性内切酶II，其有哪些特点？ （1）识别位点严格专一；（2）识别序列的碱基数一般为4，6，8个bp；（3）识别位点经常是一种回文序列的DNA；（4）仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；（5）种类繁多，应用广泛 12、简述基因组文库的构建方法 ①用适当的限制性内切酶消化基因组DNA，以得到约20kb的片段；②用限制性内切酶切割载体DNA，使其形成与外源DNA相匹配的粘性未端；③用适当的方法除去l噬菌体裂解生长非必需的内部片段；④l噬菌体载体臂与外源DNA片段连接；⑤利用体外包装系统进行噬菌体的组装；⑥重组噬菌体侵染E. coli，每一克隆中含有外源DNA的一种片段，全部克隆构成一个基因文库。 13、简述cDNA文库的构建方法 ①mRNA的提取和纯化。②合成cDNA第一链。③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖 14、怎样筛选目的基因？ （1）核酸杂交（2）PCR筛选（文库，菌落）（3）免疫筛选【解释】 15、基因组文库与cDNA文库有哪些差异？ （1）cDNA文库 包含着细胞全部mRNA信息，基因组文库 包含有生物全部的基因。 （2）cDNA文库具有组织细胞特异性，基因组文库无。 （3）cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。 （4）基因组文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA 1、乳糖操纵子阻遏蛋白的负性调控机制 没有乳糖时，1ac操纵子处于阻遏状态。I 基因在自身的启动子PI 控制下，产生阻遏蛋白R。R以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶与启动子P的结合。 当有乳糖存在时，乳糖与R结合，使R四聚体解聚成单体，失去与o的亲和力，与o解离，基因转录开放。 2、乳糖操纵子CAP的正性调控机制 cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖供给能量时，cAMP含量降低；无葡萄糖时，cAMP含量升高。 cAMP与CRP结合变为CAP，并以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。 1ac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。 3、乳糖操纵子结构特点 大肠杆菌乳糖操纵子包括：结构基因：Z、Y和A,调控元件：启动子(P)、操纵区(O)和cAMP-CRP结合位点;调节基因：lacI 4、解释细菌对葡萄糖和乳糖的利用机制 1）．当葡萄糖存在，乳糖存在时：尽管乳糖作为诱导剂和阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵序列O解离。但由于cAMP浓度较低，cAMP和CRP结合受阻，基因处于关闭状态。2）．当葡萄糖和乳糖都不存在时：CRP可以发挥正调控作用，但由于没有诱导剂，阻遏蛋白的负调控作用使基因仍处于关闭状态。3）．当葡萄糖存在，乳糖不存在时：此时无诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合。而且由于葡萄糖的存在，CRP也不能发挥正调控作用，基因处于关闭状态。 4）．当葡萄糖不存在，乳糖存在时：此时CRP可以发挥正调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去负调控作用，基因被打开，启动转录。 5、色氨酸操纵子的阻遏蛋白的负调节机制 细菌通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸。合成色氨酸所需酶类的基因E、D、C、B、A，受其上游调控蛋白R基因的调控。R并没有与O结合的活性，只有当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后而活化，能够与O结合，阻遏结构基因的转录，使基因开 ---关。