Question

碱裂解法提取质粒时，试述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的主要成分及作用原理。

Answer 1

【答案】：(1)溶液Ⅰ的主要成分为葡萄糖和EDTA。葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅助因子)。
(2)溶液Ⅱ的主要成分为氢氧化钠(NaOH)和SDS。DNA在pH5～9的溶液中是稳定的，但当pH＞12或pH＜3时，就会引起DNA双链之间氢键的解离而变性。溶液Ⅱ中NaOH浓度为0.2mob/L，加入溶液Ⅱ后，该系统的pH为12.0～12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。
(3)溶液Ⅲ的主要成分为KAc(pH4.2)。用pH4.2的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。