Question

引物设计原则是什么？

Answer 1

原则：

①引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp（注意此处所指的长度是结合到模板的长度，不包括5'端加修饰后的长度），过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。上下游引物长度差不超过4 bp，Tm差不超过2℃。

②引物序列在模板其他位置应当没有相似性较高的序列，尤其是3端，否则容易导致错配。引物3端避免出现3个以上的连续碱基如GGG或CCC。

③引物3端的末位碱基对Taq酶合成效率有较大影响，末位碱基为A的错配率明显高于其他碱基，应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

④引物序列的GC含量一般为40-60%。GC含量过低，则AT含量高，与模板结合能力低；GC含量过高，容易产生二级结构，也不利于结合模板。上下游引物的GC含量不能相差太大。

⑤引物Tm值范围为55-65℃。Tm值与PCR反应的退火温度相关，退火温度高，引物结合到模板的能力就差（但特异性好）；退火温度低，引物结合到模板的能力就强（但特异性差，非特异性产物多）。

因此，如果想提高PCR反应的特异性，可以将引物的Tm设计得高一点，这样就可以把PCR的退火温度相应设定得高一点。Tm值的计算有多种方法，长度在25 nt以内的引物可采用公式粗略计算：Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法（the nearest neighbor method）。