Question

将Bt基因转入烟草，从载体的选择到外源基因的表达，列举你用的步骤。

查了几本书都没找打答案，高分跪求详细，标准答案，

Answer 1

1、目的基因的获取，可以用以下三种方法从基因文库中获取，利用PCR技术扩增目的基因　以及人工合成法　(由于选择的是Bt毒蛋白基因来自原核生物，因此还可采用鸟枪法，直接从苏云金芽孢杆菌内获取)
2、基因表达载体的构建（即将启动子目的基因终止子标记基因组合在一起，一般顺序就是按照这样的排序，启动子最好是选择能在烟草中表达的基因所对应的启动子）
3、将目的基因导入受体细胞导入植物细胞方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 导入动物细胞方法：显微注射技术 导入微生物细胞　　用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。（由于是烟草是双子叶植物，采用土壤农杆菌的比较多，既然选择土壤农杆菌转化法，在前面制作基因表达载体时就选择土壤农杆菌的Ti质粒作为运载体，然后将含目的基因的Ti质粒导入土壤农杆菌后用其感染烟草即可）
4、目的基因的检测与鉴定　　利用DNA分子杂交技术、 抗原抗体杂交技术进行三步检测，即是否含有相应的目的基因的DNA水平的检测，含有目的基因后是否能转录出相应mRNA的RNA水平检测，转录出mRNA后是否表达出相应Bt毒蛋白的蛋白质水平的检测，当这些都检测到以后还要进行生物个体水平上的检测，即让相应的害虫吃这样的叶片看是否出现害虫的死亡。一切满足即表示转基因抗虫烟草制作成功！
望指教

Answer 2

1、目的基因的获取，可以用以下三种方法从基因文库中获取，利用PCR技术扩增目的基因　以及人工合成法　2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞导入植物细胞方法：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 导入动物细胞方法：显微注射技术 导入微生物细胞　　用钙离子处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
4、目的基因的检测与鉴定　　DNA分子杂交技术、 抗原抗体杂交技术

追问

谢谢 请问基因载体的构建方法，还有 农杆菌转化的具体步骤 还有怎样检测植物细胞内目的基因的表达