Question

ELISA法检测抗原的双抗体夹心法的一些困惑

首先，是为什么酶标不能直接标记在一抗上，标记在一抗上之后加底物显色不也可以吗？难道是因为C区已经与固相载体结合？那可以不要固相载体。其次，既然一抗二抗都能与抗原反应，那说明我们对待检抗原的结构也了解了一些吧，为什么不能用电子显微镜直接寻找呢？而且哦，说到底就是抗原抗体反应，干嘛还分直接间接竞争捕获？形式不同罢了，这样不是很难学吗？学了一学期免疫，只能看懂书上的图，但是真的活学活用就不行了。求指导。

Answer 1

我也问过这个问题。听别人给我解释，说可以直接标记在一抗上然后加底物显色，但是那样的话，放大效果没有加二抗的好。

Answer 2

双抗体夹心法原理：固相载体上包被抗体，再加入待测抗原（可以是血清或者其它样本），洗板（洗掉非特异性吸附），再加入酶标抗体，再洗板（洗掉非特异性吸附），再加底物显色。
这里有几点需要注意：①抗原是大分子抗原，具有2个以上的抗原表位；②包被抗体和酶标记的抗体都是针对抗原的特异性抗体，只不过它们分别针对的是不同抗原表位，经常被称作一抗和二抗；③酶是催化底物显色的，起到一个信号放大作用。

Answer 3

有一抗标记生物素的。但如楼上说的，在二抗上加更商业化。固相载体是必要的，方便洗去杂质。可以使用fret(荧光)技术、噬菌体展示、核糖体展示等观察抗体抗原互作，但这都是科研上用的，ELISA或其试剂盒在实用的检测更直观具体，且可以定量。方法相通，但具体细节决定一切。方法不同决定检测准确度，这是由于与抗体结合的抗原决定簇是唯一的，不同的具有相同的结构域的抗原能与同类抗体结合，所以需要不同的结合部位的特异抗体去二次多次筛选。

Answer 4

不直接标记一抗而标记二抗，这是从生产成本上考虑的。二抗大部分是通用的，标记一次可以大量标记，比如10ml或者更多的浓缩液，可以生产上千上万的试剂盒。一次检测就行了
而一抗种类很多，量少，如果标记一抗，比较费事。次次得检测（标记完得检测）。HRP标记不是很简单的事
科研用的试剂盒。单品销售量很小的，不值当。
但临床上的ELISA试剂盒是直接标记在一抗上的，他们量大。这样也用着简单。
还有一个，科研试剂盒也不一定用的酶标二抗，有的是生物素放大系统，这样提离灵敏度。