Question

如何从冻存的细胞提取RNA十万火

Answer 1

1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出；
2). 不待细胞溶解，将Trizol500ul-1ml直接放入冻存管中，此时Trizol会冻成冰状；
3). 将冻存管缓慢融化，并用加样器吹打混匀；
4). 将细胞裂解液移至Eppendorf管中，16000′g离心1min，吸出管底絮状沉淀;
注释：该步骤并非必要，多数Protocol省略该步骤，但加入该步中能明显提高RNA的质量；注意不能离心时间过长，否则沉淀难以吸出，将200ul黄枪头尖部切去0.5cm操作；
5). 加入1/5体积的氯仿（约200ul）,上下颠倒2~3min；
6). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻吸出上清至新的Eppendorf管（约700ul ），不要扰动中间层或用手指使Eppendorf管变温；
注释：一般情况下提取的RNA已经足够，而且在逆转录过程中RNA的质量要远较RNA的数量更重要，一般仅取上清的上1/2左右足矣，这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动；
7). 加入等体积异丙醇（约800ul）,充分混匀，冰上静置15min；
8). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
9). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
10). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发；
11). 用100ul 新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA，如果溶解不好，-20℃反复冻融1~2次，4℃ 16000′g离心3min，将上清吸至新的Eppendorf管中；
12). 加入等体积12 M LiCl，-20℃静置15min；
13). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步骤的目的在于去除小分子降解RNA和盐分；但可以省略；只有大分子RNA在高浓度LiCl中沉淀，DNA不会沉淀；
14). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步的目的在于去除LiCl，LiCl溶于乙醇，而RNA不溶于乙醇，利用溶解度分离；
15). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发RNA边缘呈半透明；
16). 用40ul新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA；
17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳，其余冻存-70℃。
注释：如果OD260/OD280＜1.8，则加入等体积Trizol，按上述步骤重新提纯。

Answer 2

用biog提取
1. 加入200μL裂解液，20 μL 消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10 分钟至细胞完全裂解。
2. 加入500μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验。
3. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置2 分钟，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。
4. 将吸附柱放回收集管内，加500μL 洗涤液至吸附柱内，12,000 rpm 4℃离心1 分钟，弃收集管内废液。
5. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 4℃离心2 分钟，离去残留的洗涤液。
6. 取出吸附柱，放入新的无RNA酶的1.5 mL 离心管内，加入50-200μL 洗脱液，静置3 分钟，12,000 rpm 4℃ 离心2 分钟，收集RNA溶液。