Question

求助：预做蛋白的N末端测序，如何准备样品

Answer 1

N-末端测定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一.
DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸.Sanger用此方法测定了胰岛素的N57361;末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸.
B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N57361;末端的新方法,步骤如下：
由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基酸,鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸.
C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯.它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger的DNFB法,产物是磺酰胺衍生物.
丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光.此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP57361;氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定.