紫外吸收法测定蛋白质含量
紫外吸收法测定蛋白质含量_生物化学实验指导
实验一 紫外吸收法测定蛋白质含量
【实验目的】
1．掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2．掌握蛋白质标准浓度曲线的绘制方法。
3．了解紫外吸收法的优缺点和适用范围。
【实验原理】
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。
各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。该法测定范围为0．01～1．0 mg/ml。
样品中核酸对紫外光的吸收会影响蛋白质浓度的测定结果，但核酸的吸收高峰在260nm附近。纯蛋白质的A280与A260的光吸收比值约为1．8，而纯核酸的A280与A260光吸收比值约为0．5。
通过测定A280与A260的值，利用经验公式或校正表能大致计算出不纯样品的蛋白质浓度。
紫外吸收法测定蛋白质含量的优点:简便、灵敏、快速，不破坏蛋白质也不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐不干扰测定，如生化制备中常用的硫酸铵和大多数缓冲液等。
特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
该方法的缺点在于:测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。虽然可以通过校正表的计算减少核酸的干扰，但测定的结果仍存在一定的误差。
【实验器材】
紫外分光光度计、试管和试管架、微量移液器和枪头。
【药品试剂】
1．浓度为1 mg/ml的标准蛋白溶液。
2．待测蛋白A溶液和B溶液(A为纯蛋白质;B为含核酸的蛋白质)。
【实验方法】
1．绘制蛋白质标准浓度曲线:标记试管，按表3-1依次向试管中加入各溶液，充分混匀。取光径为1 cm的石英比色杯，以“0”管调节零点，测定各管溶液在280 nm处的光吸收值。以蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标，光吸收值(A280)为纵坐标做标准曲线。
