Question

RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

Answer 1

细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％,tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%,mRNA约占1%-5%,由于rRNA占绝大多数,因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA,它也有三种类型：28S,18S,5S.所以我们看到的也应该是三条带,而且28S的亮度为18S的两倍.这样的RNA才可以用来建库.
在RNA的提取时,一定要注意RNase的污染,因RNA极易被RNase的降解,操作时应尽量少说话,并在洁净的环境中操作,主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,可以不经处理直接用于提取RNA,实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染,使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）,另外,由于材料不同,机体内含有的糖、酚类物质不一样,因此材料不同用的方法也应该不一样.
下面是两种提取方法,第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取,第二种适用于老组织的提取.
试剂：提取缓冲液,KAc(5M),异丙醇,无水乙醇,DEPC水
仪器：离心机,恒温水浴锅,研钵
方法一 动物、植物（嫩叶）的总RNA分离
大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨
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加5mlTrizol裂解液
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12000rpm ,4度,10分钟
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加入1ml氯仿
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剧烈振荡15秒,室温温育2-3分钟
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室温离心10分钟,8000rpm
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取上清,加入等体积的异丙醇,15-30度放置10分钟.
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12000g离心10分钟
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弃上清,加入10ml75%洒精洗沉淀.
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2-8度下,不超过7500g离心5分钟
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弃上清,干燥沉淀10分钟
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用DEPC水溶.
方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离
1g组织液氮研磨,加入6ML提取缓冲液
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2min振荡
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65℃,20min
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加入1.5MLKAc
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混匀,冰浴20min
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8000rpm,4℃,15min
取上清,加入0.6倍异丙醇,-20℃,1小时（或室温15-20min）
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12000rpm,4℃,15min
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75%乙醇,12000rpm,20℃,5min
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晾干,溶60ulDEPC水,15min
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12000rpm,4℃,5min,上清即为RNA.,10,需要防止RNA降解，用华越洋的外源RNA酶清除剂，处理耗材，器具，台面等。,0,RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些
稀碱法提取实验