Question

请举例一个利用质体基因转化改良农作物的实例，详细阐述其原理及技术操作步骤

Answer 1

问：请举例一个利用质体基因转化改良农作物的实例，详细阐述其原理及技术操作步骤

问：叶绿体是染色体外衣穿研究的主要对象，请举例一个利用质体基因转化改良农作物的实例，详细阐述其原理及技术操作步骤

答：您好，以马铃薯为例。马铃薯(Solanum tuberosum L．)是世界第四大粮食作物且用途广泛，发展其生产具有重要的意义。近年来，马铃薯常规育种工作遇到了难以跨越的“生物学路障”，而基因工程技术对于转移目标性状具有很大的目的性，已经成为目前改良作物品性的重要手段。原生质体作转化受体较传统外植体更能整合大片段DNA，但目前马铃薯这方面的研究还不够充分。 本研究以马铃薯无性系8~#(2n=4x=48)为材料，分离其叶肉原生质体作转化受体，选用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因，采用共孵育(原生质体与质粒DNA直接融合)法，PEG介导转化法和电击穿孔转化法，将外源质粒(pBIN m-gfp5-ER和SK-gfp)DNA转化到马铃薯原生质体中。通过转化子中绿色荧光蛋白的表达，研究马铃薯原生质体遗传转化技术体系。主要结果如下： 1．SK-gfp转化载体的构建 从pBIN m-gfp5-ER(14.7kb)上酶切出gfp基因，装入SK载体，构建SK-gfp质粒，长度约4.8kb，gfp基因经序列测定，与pBIN m-gfp5-ER上gfp序列比对，相似性为100％。 2．共孵育 即将一定浓度的外源DNA(60、80、100μg／mL)和纯化后的原生质体直接共培养，共得到163个愈伤组织，其中转化子30个，转化效率18.4％。 3．PEG介导转化 纯化后的原生质体用PSL(甘露醇0.3mol／L，MgCL_2 15mmol／L，MES 0.1％，pH 5.8，高温灭菌)悬浮，加入一定浓度的质粒DNA(75、100μg／mL)，充分混匀后静置片刻，然后均匀地滴于无菌培养皿的底部，静置3min，待大多数细胞沉降后，在每滴正上方加等量的12.5％或25％的PEG溶液，分别静置10min或5min，诱导外源DNA进入原生质体。共得到愈伤组织149个，有70个是转化子，转化效率为47.0％，其中PEG(12.5％，10min)的转化效率为51.9％，高于PEG(25％，5min)的44.2％，且二者之间在P=0.05水平上存在显著性差异。 4．电击穿孔转化 电转化仪：Eppendorf Multiporator 4308型，转化室为250μL螺旋型铂金电极，间距0.02cm；电转化液的组成：0.35mol／L甘露醇+0.1mMCaCl_2，pH

答：pH 5.8，高温灭菌；脉冲电压为20v，脉冲次数n=1。得到愈伤组织312个，其中转化子183个，转化效率最高，达到58.7％。 5．比较外源DNA长度对转化效率的影响时发现，共培养转化和电击穿孔转化时，SK-gfp的转化效率比pBIN m-gfp5-ER的高；而在PEG介导转化中出现了相反的情况。 6．通过研究DNA浓度与转化效率的关系发现：只有在共培养转化时，DNA浓度为80μg／mL的转化效率与60、100μg／mL的效率在P=0.05水平上存在显著性差异，PEG介导转化和电击穿孔转化时设立的两浓度(75、100μg／mL)所对应的转化效率不存在显著性差异。 7．三种转化方法共得到愈伤组织624个，其中转化子283个。

问：六.2022年12月7日浙江六学医学院附属邵逸夫医院与浙江大学在国际顶级人 期刊《自然》(Nature)上发表了题为“基于植物来源的天然光合作用系统增强细胞合成代谢”(A plant-derived natural photosynthetic system for improving cell anabolism)的学术论文，提出了利用植物来源的光合作用系统增强哺乳动物细胞合成代谢的新医疗模式。该研究对你有哪些方面启发？请展望这一创新性技术在医学、能源及材料等领域有哪些应用？叶绿体是染色体外遮传研究的主要对象，请列举1个利用质体基因转化改良农作物的实例，并详细阐述其原理及技术操作步骤。(请逐条列出，分别用阿拉伯数字标注清更戈涉级，各理清晰，共20分。)

答：原则上只能回答一个问题