Question

Sanger的链终止法测序技术发展到荧光标记自动化测序,经历了哪些技术改进?

Answer 1

问：Sanger的链终止法测序技术发展到荧光标记自动化测序,经历了哪些技术改进?

问：举例说明新一代测序的原理及优点

答：您好，很高兴为您解答。该技术利用焦磷酸测序法进行测序，使用边合成边测序技术，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆问题。基本步骤为：构建测序文库、乳液PCR扩增、测序。测序原理主要是将微孔板置于流通池内，通过连续流动依次向流通池内加入4种dNTPs。当有配对时释放出1 个焦磷酸分子，并在ATP 硫酸化酶催化下与5’-磷酰硫酸结合形成ATP，在荧光素酶催化下ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素并产生可见光，被仪器实时检测。另外，三磷酸腺苷双磷酸酶不断地降解未参与反应的核苷酸和ATP，猝灭光信号，再次形成新的反应体系，快速测定序列。该方法的优点是读取的序列长度较长，且没有较复杂的化学反应，不需连接及切除荧光基团，减少了错误的发生。焦磷酸测序法使用的是无需化学修饰的dNTPs，信号被实时检测，比Sanger测序拥有较大优势。其局限性是当其遇到寡聚单核苷酸序列时，需根据光信号强度自我判断，易引入插入和缺失等错误，随着读长的增加，错误率也相应升高。