Question

根据cDNA序列如何设计特殊引物已知cDNA序列，如何用PCR的方法得到其表达克隆的RT-PCR引物？

Answer 1

问：根据cDNA序列如何设计特殊引物已知cDNA序列，如何用PCR的方法得到其表达克隆的RT-PCR引物？

答：您好，这个需要看你的模板，如果模板是cDNA就可以在上面设计引物。如果模板是基因组DNA就要注意了，以cDNA为模板设计引物，如果引物正好跨外显子，就扩不出来

答：如果你已知序列，就可以直接设计引物了，很简单，只需要在设计的时候注意一下互补啥的就行了。如果还不清楚序列，那就查下这个基因在别的相近物种上是否有已知的序列，如果有，那就找出同源序列，再设计

答：PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物