Question

PCR扩增时很容易将目的基因片段的旁侧区域也扩增出一部分,如何保障PCR扩增的

Answer 1

问：PCR扩增时很容易将目的基因片段的旁侧区域也扩增出一部分,如何保障PCR扩增的

答：您好，您的问题我已经看到了，正在整理答案，请您稍等一会儿～

答：    疫情当下，最热频的词汇莫过于核酸检测了。而核酸检测最核心的技术也越来越被大众所熟知，就是我们高中就学过的聚合酶链式反应，又称为PCR。        自从1983年，Kary Mullis才发明出这个用于扩增目标DNA的研究工具—PCR技术后，其逐渐成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。而Kary Mullis也因这一发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。        而熟悉PCR的同学们都知道，PCR之所以能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍以便于下游实验检测，主要依靠这三个步骤连续多次循环而实现：       （1） DNA变性：首先对双链DNA模板进行高温加热，使DNA双链变性解离成单链；       （2） 引物退火：被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；       （3） 延伸扩增：DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。         而PCR这项核心技术的核心是强大的DNA聚合酶，其在新DNA链合成中扮演着重要的角色，是PCR反应不可或缺的组成部分，是保证PCR扩增产物特异性、热稳定性、保真度等方便的重要因素。        而对目的基因进行PCR扩增的过程中，延伸错配的非特异产物和引物二聚体的产生是PCR实验中常遇到的问题，这些都与DNA聚合酶有关。因为这种非特异扩增会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。        那么，问题来了，如何减少非特异性扩增？        方案之一：在冰上配制PCR反应，这是我们经常的操作。因为这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平。        但在PCR开始之前，依然可能会合成不需要的产物。        另一个办法是将DNA聚合酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。所以后来为了避免非特异性扩增，科学家们开始进行手动热启动PCR反应，但是这个过程不仅费时费力，而且会增加样品污染和降低实验可重复性的风险。