Question

在反转录制备cDNA的第一阶段,加入引物和模板RNA以后,需要65度变性处理5分钟,

Answer 1

问：在反转录制备cDNA的第一阶段,加入引物和模板RNA以后,需要65度变性处理5分钟,

答：请稍等一下

问：这一步有什么作用？为什么？

答：请稍等一下，这在查找信息

答：您好，在反转录制cDNA的第一阶段,加入引物和模板RNA以后,需要65度变性处理5分钟答案如下: 引物是热稳定DNA聚合酶的结合位点,能够使子链合成时按照5’—〉3’的方向进行,不设置引物根本就没办法进行互补链的合成,因此尽管只有一条链也应该设置引物.一条模版合成了互补链后,在加热解链后,模板链和互补链均可再做下一次PCR合成的模版,按照指数增长方式快速的合成多个DNA.

答：您好，反转录的实验步骤如下:（1）、从细胞中提取细胞总RNA用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA。按试剂使用说明操作:离心收集细胞，倾去细胞液，向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞)，混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打，直至细胞完全裂解成均一溶液，不粘稠时为止。随后加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒钟，室温放置5分钟，然后，4 0C ,12000rpm离心5分钟，将上层水相转移至一Eppendorf管中，加入500ul异丙醇后混匀。4 0C , 1 5000rpm离心15分钟，倾出异丙醇。用70%乙醇洗涤沉淀一次，置冰上，让残余乙醇挥发殆尽。溶于适量的DEPC水中，紫外分光仪测定RNA的纯度及含量，分装冻存于一700C保存.（2）、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)在20ul体系中，加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l

答：8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水，70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却，继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种)，混匀后于42℃保温2分钟，加入1ul( 200U)的反转录酶，42℃继续温育50分钟。700C 15分钟灭活反转录酶。（3）、 引物设计(4)过程: 以1ulcDNA为模板，在50ul体系中含有Taq酶为2单位，dNTPs浓度为200uM，引物各为0.2uM。扩增22个循环。取8ul电泳。

问：pcr收到了正向引物2.5nmol，反向因为3.2nmol，当把它们统一配成100uM的储存液，分别需要加入多少te缓冲液

答：稍等一下，我查一下

答：您好，您的这个问题我无法回答，但我们有一个套餐，每一月只需要29.9元，您可以包一个月，24小时都都有专业的老师为您回答的

答：聚合酶链式反应实验(PCR)过程简介与常见问题我们都知道DNA可以在体内进行半保留复制，生物学家总是能展开想象的翅膀，既然DNA能在体内复制，那有没有什么办法让它也可以在体外复制呢？这个问题在1985年被Kary B. Mullis解决了。他发明了一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法——PCR。Mullis因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR反应体系1、模板模板可以是DNA、cDNA等。2、引物引物是DNA短片段，或称寡聚脱氧核糖核苷酸，用以引导起始聚合酶反应。3、dNTP即脱氧核糖核苷酸。4、DNA聚合酶实验中最常用的是Taq DNA聚合酶，其可以耐受90℃以上的温度。5、缓冲液用来稳定反应的，有些缓冲液含Mg2+（Mg2+可以激活DNA聚合酶），有些缓冲液不含Mg2+。①含Mg2+的，可以直接使用；②不含Mg2+，通常于需要改变Mg2+浓度来优

答：化PCR反应体系的实验。6、ddH2O不含任何抑制反应的离子。PCR反应参数①94℃ 5min （预变性，目的是让模板更好地打开，预变性一般是94℃，2~10min）②94℃ 1min （变性）③55℃ 1min （退火，不同的PCR反应，退火温度不同，其取决于引物的长短、浓度）④72℃ 2min （延伸，这是Taq酶的催化反应，该酶的延伸速度是1000bp/min，根据片段的大小可以适当缩短或延长延伸的时间）⑤72℃ 10min （补齐，把没有反应完全的片段进行补齐）变性、退火、延伸的循环次数一般是25~30次。