实时荧光定量pcr流程
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1. 总RNA抽提
(1) 取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
(2) 取100mg组织，加入到匀浆器中。
(3) 充分研磨直至无可见组织块。
(4) 12000rpm离心10min取上清。
(5) 加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
(6) 4℃ 下12000rpm离心10min。
(7) 将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
(8) -20℃ 放置15min。
(9) 4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
(10) 吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
(11) 4℃下12000rpm离心5min。
(12) 将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
(13) 加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
(14) 55℃ 孵育5min。
(15) 使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
(16) 将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为
咨询记录 · 回答于2023-12-22
实时荧光定量pcr流程
1. 总RNA抽提
a. 枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶
b. 取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷
c. 取100mg组织，加入到匀浆器中
d. 充分研磨直至无可见组织块
e. 12000rpm离心10min取上清
f. 加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min
g. 4℃ 下12000rpm离心10min
h. 将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀
i. -20℃ 放置15min
j. 4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA
k. 吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀
l. 4℃下12000rpm离心5min
m. 将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min
n. 加入15μl无RNA酶的水溶解RNA
o. 55℃ 孵育5min
p. 使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测
q. 将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为
2. 反转录
1. 取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2. 加入1μl 逆转录引物。
3. 用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4. 于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却。
5. 依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
6. 于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。
注意：在操作过程中，确保所有试剂和工具都经过湿热灭菌，并且无RNA酶污染。
# 定量PCR
## 反应体系
1. 取0.2ml PCR管
2. 配制如下反应体系
* 每个反转录产物配制3管
* 2× qPCR Mix: 12.5μl
* 7.5μM基因引物: 2.0μl
* 反转录产物: 2.5μl
* ddH2O: 8.0μl
## PCR扩增预变性
95℃，10min
## 循环（40次）
1. 95℃，15s
2. 60℃，60s
## 熔解曲线
75℃→95℃，每20s升温1℃
4、结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)K=A-B表达倍数=2-K
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本回答由GRS塑料提供