Question

pcr技术原理

Answer 1

pcr技术原理是在存在DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液(Mg2+)的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。
PCR反应体系为100μL的PCR反应，其反应混合物为：
1、模板DNA0.1～2μg。
2、前后引物各20pmol。
3、20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH值8.3)。
4、1.5mmol/L氯化镁。
5、0.05%Tween20。
6、100mg/L灭菌的明胶或无核酸酶的牛血清蛋白。
8、1000μmol/L的四种dNTP。
9、25mmol/LKCl。
10、2U的TaqDNA酶。
pcr检测的优点：
1、灵敏度高、快速简便
PCR反应的扩增方式是以指数方式增加的，能在极短的时间内得到大量的目的片段。Mullis等人采用PCR诊断镰刀型细胞贫血症，结果表明其灵敏度比Southern印迹杂交高100倍。
2、特异性高
PCR反应的特异性取决于：引物与模板DNA特异性结合。碱基互补配对原则。TaqDNA聚合酶合成DNA时碱基错配率低。
3、模板纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。