Question

提取染色体dna的基本原理，操作中注意什么

Answer 1

DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。
注意事项：
1.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。
2.防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子螯和剂螯和Mg2+以抑制DNase的活性。
3.减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase大量释放，样品反复冻融和高温等。

Answer 2

提染色体dna的基本原理：
基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事，细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。
另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。
大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3 R2 —蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌，所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要学成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷键，有助于细胞壁破裂，破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌，同时用蛋白酶K 消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质，然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。

提染色体dna的注意事项：
1、 重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。
2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水，以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解，后面还需去离子。
3、 取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。