Question

为什么trizol提不出来rna

Answer 1

trizol提不出来rna的原因有可能是以下原因：

1）你的Trizol试剂核有无问题？
2）研究材料是否新鲜，RNA容易降解，应妇80度保存。
3）如果都没问题，你的操作有无问题？

trizol提取rna的步骤：（仅供参考）

用户需自备的试剂和材料 

无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free） 

 

准备工作 

RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 

RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 

料制品的处理 

尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 

1. 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。

2. 处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 

3. 在通风柜中室温处理过夜。

4. 将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。

5. 烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 

 璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 

从组织中提取总RNA

1. 液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。

2. 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 

 从细胞中提取总RNA

1. 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按250px2/ml比例加入。

2. 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。 

 

操作步骤 

1. 细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

2. 12,000rpm 离心5min，弃沉淀。 

3. 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

4. 4℃ 12,000g离心15min。

5. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。

6. 按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7. 4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8. 按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

9.  4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。

10. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

11. 可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。

12. 测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。

注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；

高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；

热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；

组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。