Question

定量PCR，半定量PCR和相对定量PCR有什么差异

Answer 1

所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。其原理是在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 更专业的解答可联系广州双螺旋基因技术有限公司，产品服务：广州双螺旋基因技术有限公司专注于检测设备及配套试剂的研发、生产及销售，致力于为客户提供分子检测整体服务体系，目前已推出检测仪器与检测试剂等多种产品，涵盖水产养殖病害检测、致病微生物检测、物种鉴定等多个应用领域。谢谢！

Answer 2

• 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种：

• ①有限稀释法，即倍比稀释法： 通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模 板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点。优点是不需要特殊设备，缺点是扩增反应条件要标准化，严格注意污染，避免假阳性的产生。

• ②使用 外参照物的定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后做出标准曲线图，未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数。荧光定量PCR通 常使用该法做标准曲线。

• ③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样，在同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标 序列。

• 通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量:

• 方法A、设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物，优化引物配比的条件。

• 方法B、在指数增长期实现 对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增。

• 方法C、PCR产物琼脂糖凝胶电泳，EB 染色。方法

• D、电泳条带的紫外光下分析。方法E、二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等。该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时，才能对两者相对 定量；也是对处于扩增指数期的PCR产物定量。

• ④使用竞争性内参照物的定量PCR：同样的反应条件，同一个试管，用同一对引物，同步扩增靶序列和内参照序 列。靶基因的量可通基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变。目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失通过基因重组技术 插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段，或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板。竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶 切、杂交、显色等手段实现）。常用的荧光定量为TaqMan探针技术，他特异的和目的片段结合，只是用的是TaqMan。半定量RT-PCR用做内参照， 也应该是第三种，只是它是普通PCR，通过电泳的条带强弱，与GAPDH的比值，分析他们的灰度值半定量，个人认为数据不可靠，应该用TaqMan做相对 定量或绝对定量。用rt-pcr比较两株细胞表达量的差异的时候，不一定要把两株细胞调整为相同浓度，因为要做内参照，可以校正模板量的差异

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Answer 3

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（BIOG sybr green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（BIOG taqman),通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.