Question

酶切后PCR一条带都没有 但原质粒PCR有条带 为什么

做MUCIN基因 从扩增、 切胶纯化、 加A 、T载体链接、 转入感受态 到挑克隆鉴定出阳性克隆 最后提质粒 取一部分提出的质粒双酶切 质粒与酶切产物同时跑电泳鉴定 原质粒有条带 可是酶切一条也没有 为什么

Answer 1

什么酶呢？最后酶切组的电泳条带是弥散，是只有质粒条带没有酶切产物条带，还是干脆就是空白？

如果是弥散，最有可能的是所用的酶的反应条件要求比较严格，因为掌握不当而产生了星号活性，导致把质粒切碎了。建议查一下所用酶的酶切条件。

如果是有质粒条带而没有短片段条带，也就是说没切开了。可能酶切位点发生了突变，也可能是酶失活了。

如果是空白...我也不知道怎么回事儿了...再重复一次吧。

如果认为之前的步骤都没什么问题，不如直接送测序。比酶切检验还要精确呢。

祝实验顺利。

Answer 2

提取的质粒浓度太低也说不定，碱抽时最后一步加的TE量是不是太多呢？！
或者你的酶已经被污染了，因为非特异性酶切的产生，导致所得到的片段都很小，在电泳结束时已经跑出了胶。这种情况下可以短时间跑胶看看结果，不过感觉可能性不大。。

Answer 3

控制消化时间，先单酶切看看。还有，你那个质粒的条带亮不亮？如果比较模糊，由于浓度太低，就可能出现酶切后什么都没了的情况。

Answer 4

降解了。