Question

鞭毛染色法准确鉴定细菌是否具有鞭毛，要注意哪些细节

Answer 1

鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛的数目和附着于细菌的位置是细菌的一项重要形态特征。细菌的鞭毛很纤细。除了很少数形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛的存在外，多数细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
1、实验材料
①鞭毛染色液。
②菌种。有鞭毛的细菌。
③其他。玻片、接种环、吸管等。
2、注意事项
①良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
②玻片应光滑、洁净，不可带油迹。不洁净的载玻片可经含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出后用清水充分洗净，沥干水后置95%酒精中处理，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
③挑取菌时，尽可能不带培养基。
④配制合格的染色剂（尤其是B液 ）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的关键。（1）改良Ryn鞭毛染色法
①玻片的处理。要求用新的载玻片，用前须在95%酒精中浸泡24h以上，用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。
②在玻片上滴蒸馏水两滴。1张玻片上可同时制2个涂片。
③用接种环挑取血平板上菌少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部，一般只需点一下，只允许极少量的细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。
④玻片置室温自然干燥 。
⑤滴加染液于玻片上染色。
⑥约10—15min后，用自来水缓慢冲去染液，冲洗时应避免染液表面的金属光泽膜滞留在玻片上，影响镜检。
⑦玻片自然干燥后，镜检时应以涂片的边缘开始，逐渐移向中心。原因是边缘细菌较少且相互分开，鞭毛容易观察。细菌密集的地方鞭毛被菌体挡住，不易观察。
结果：菌体和鞭毛均染成淡紫色。
（2）硝酸银染色法
①活化菌种。冰箱中保存的菌种，通常要连续移种1—2次后，接种于新配制的营养琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水），28—32°培养10—14h，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色材料；或点种于新制备的营养琼脂（含8—10g/l的琼脂 ）平板中央，28—32°培养18—30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落 中央的菌苔 ）作染色材料。
②制备菌液。取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1—2ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液好。
③制片。取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流 向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或 162温室）自然干燥 。干后应尽快染色。
④染色。滴加硝酸银染色A液，染3—5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥 。
⑤镜检。用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛。
结果：菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
（3）改良的Leifson染色法
①活化菌种同硝酸银染色法。
②制片。用记号笔在载玻片反面将玻片分成3—4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37°, 自然干燥 。
③染色。加Leifson染色液覆盖第一区的涂面，数分钟后，加染液于第二区涂面，如此继续染第三区、第四区。在染色过程中注意观察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时，直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再清洗，否则背景不清 ），染色时间大约10min。
④镜检。自然干燥后，油镜检查。
结果：菌体和鞭毛均呈红色。