分子生物学实验方法
实验1总DNA提取
生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]
学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]
植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。
[实验器材]
1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料
[实验试剂]
1、3×CTABbuffer（pH8.0）
100mMTris
25mMEDTA
1.5MNaCl
3%CTAB
2%β-巯基乙醇
2、TE缓冲液（pH8.0）
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA
3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）
4、95％乙醇
5、液氮
[实验步骤]
1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。
4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。
5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。
6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）
7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。
8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。
9、将粗制品溶于TE缓冲液。
10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。
[注意事项]
1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。
2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。
[思考题]
CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？
液氮研磨的原理是什么？
实验二质粒DNA的提取
质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的`双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。
[实验目的]
通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。
[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速
而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验器材]
1、恒温培养箱
2、恒温摇床
3、台式离心机
4、高压灭菌锅
5、Tip头、Eppendorg管
6、含有目的质粒的E.coli菌株
[实验试剂]
1、溶液I
50mmol/L葡萄糖
5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl
10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）
2、溶液II
0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合
3、溶液III
5mol/L乙酸钾60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
4、TE缓冲液
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA(pH8.0)
5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）
6、EcoRI及其缓冲液
7、HindIII及其缓冲液
[实验步骤]
1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。
6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。
9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。
10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。
[注意事项]
操作时，避免剧烈震荡。
[思考题]
1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？
2、SDS和NaOH的作用是什么？
[参考文献]
《精编分子生物学实验指南》（第四版）
[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005
实验三总RNA提取
【目的和要求】
1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。
2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。
3．了解RNA提取过程中的注意事项。
【实验原理】
RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。
【教学内容】
1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍
2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。
3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。
【实验器材和试剂】
超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。
玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）
TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。
【实验方法】
（一）异硫氰酸胍法（PLT）
1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴
中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。
2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。
3．加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。
4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.
5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.
6．4℃，离心12000r/min，15min.
7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。
8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。
9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。
（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂
TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：
1.匀浆处理（Homogenization）
（1）组织中提取总RNA
①植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。
②动物组织：按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。
（2）培养细胞中提取总RNA
①贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。
②悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。
（3）血液中提取总RNA
直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。
2．分层（PhaseSeparation）
（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。
注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。
