如何构建一个基因的过表达载体
当拿到一个基因的DNA片段后，就需要把它导入一个载体，一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。
常用的载体有细菌质粒，噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。所谓载就是一个很长的环状DNA，携带一些基因，可以导入细菌中自我复制，也可以从细菌中提取出来改造。
现在我们就需要把SUN片段连到一个载体，用VectorNTI打开，研究一下用哪个酶处理，这个载体需要用Sma1这个酶切开，然后用SUN连上，替换切下来的ccdb，这里要用到两个酶，一个Sma1限制性内切酶切开，一个DNA连接酶把新片段连上，植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。
载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制，这里就要用到大肠杆菌的感受态了，十把构建好的载体和感受态混合，然后放到42度热水处理个1分钟，再冰上放个3分钟。
这时需要一些培养细菌的培养基来培养菌们，大肠杆菌这种菌很好养活，唯一需要注意的是，灭菌过后的培养基要小心保存。把在冰上处理过的大肠杆菌放到培养基中培养一天，为了防止没有转入载体的菌也混进来，我们在载体上加入了一个抵抗抗生素的基因。
这样我们在培养基中加入这种抗生素，在里面就只有需要的大肠杆菌能生长了。最后得到了上亿个携带着含有我们的SUN基因的载体的大肠杆菌，这时就需要把质粒再提出来。
实验室里提质粒需要用专门的试剂盒，也可以简化一下，先把菌液离心让菌沉淀，然后再用水把菌打散，然后煮沸1分钟再离心，取上清，上清中加乙醇让DNA析出，再离心让DNA沉淀，最后用水把DNA溶解。这样提出来的DNA会有很多杂质以及细菌的基因组DNA。
扩展资料：
目的基因与运载体结合：
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，
要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处。
首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来。
形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。
参考资料来源：百度百科-基因表达载体
一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。
过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。常规过表达载体主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。基因过表达载体又可以分为广泛启动子基因表达载体，组织特异性启动子基因表达载体和诱导启动子基因表达载体等，以达到不同研究所需要的目的。根据不同研究需要，选择合适的过表达载体。
二、目的基因的获得
调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段。
全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接通过公司合成目的基因。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。
三、载体构建实验方法
1.引物设计：
酶切酶连方法的引物设计：设计特异性的目的片段扩增引物，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入两个合适的酶切位点（需要扩增的目的片段上无选择的酶切位点）及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。
同源重组方法的引物设计：设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点及该酶切位点在载体中对应前面的15个碱基载体片段，下游引物5’端前面加的是相同的酶切位点及该酶切位点在载体中对应后面的15个碱基载体片段，如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确，将目标片段扩增出来后以便与载体连接。
2.PCR扩增：
以研究对象的DNA/cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入合适的酶切位点，使用1%琼脂糖凝胶（根据片段大小选择不同浓度的琼脂糖凝胶）电泳检测和回收回收目的基因DNA条带。
3.载体和目标片段的限制性酶切：
质粒载体和目的基因PCR产物的进行双酶切；使用琼脂糖凝胶（根据片段大小选择不同浓度的琼脂糖凝胶）电泳检测和回收1%琼脂糖凝胶电泳分别回收载体片段部分质粒载体酶切大片段和目的基因酶切片段。
4.连接转化：
使用DNA连接酶进行载体片段部分和目的基因酶切片段质粒酶切回收大片段与目的基因连接的连接，连接反应在16℃反应12 h小时。取10 µL连接产物与100 µL DH5α感受态细胞细菌混匀后冰浴30 min，42℃热激90 s，立即置冰上放置5 min，加入预热至室温的700 µL LB培养基， 37℃恒温摇床培养50 min，吸取 200 µL的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100 µg/mL Ampicillin抗性的LB平板上（根据载体上的抗性筛选标记选择合适的抗性平板，以 Ampicillin抗性为例）， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
5.挑取克隆提质粒验证：
（1）菌落PCR验证：挑取5-10个单菌落直接进行PCR验证。
（2）酶切验证：PCR验证阳性的菌落接种于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培养液中，300 rpm，37℃恒温摇床培养过夜。收集菌体，使用，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进行酶切验证。（也可以不进行酶切验证，直接进测序验证。）
（3）测序验证。
