Question

【求助】菌落PCR有目的条带与菌液PCR却什么都没有?

Answer 1

高手们好.最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行PCR时可以见到有目的条带；当把菌落接种到LB液扩菌后,以菌液为模板进行PCR时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行PCR检测,再重新以菌液为模板进行PCR检测,因为菌落或者菌液PCR假阳性的几率还是比较高的.但如果还是出现以上结果,推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的,此时建议再提质粒做PCR检测和酶切检测来彻底证明你的目的片段是否真正与载体连接成功.
个人的见解希望对你有所帮助,也期望高手们批评指正!我觉得菌落PCR效果很好,虽然有假阳性的可能,但是只要是做出来,有目的条带一般是对的,你为什么还要用菌液做PCR?你还不如摇菌后提取质粒然后用质粒PCR或者酶切.既然你说到这个问题了,我觉得很有可能是你的质粒被稀释了,因为在菌落中的浓度比较大.另外也有可能是你根本就没有挑到正确的菌落来摇菌,所以就没有质粒,怎么能做出来.我觉得你做菌液的PCR和菌液的PCR必须是从单一的一个菌落挑出来的,如果不是,那肯定只有一个是正确的,我做过,只要是同一菌落不会有差错.你再试试看,谢谢各位高手的及时的回答.现在我都是挑单个菌落后摇菌,然后提取质粒,然后以质粒为模板做PCR,阳性的质粒再酶切进行鉴定,效果还可以.再次谢谢大家!第二次看到这种观点,不确定对不对,借道跟大家讨论一下,不知道lcc有没有文献支持一下这种观点?如果这种观点正确,那我以前很多关于T载体的看法就错了,所以很感兴趣.我一直以为外面的DNA片段会被大肠杆菌分泌出来的核酸酶降解.
lcc_0 wrote:推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的说来也很奇怪,以前我就是挑菌后加到LB液后摇菌,然后以菌液为模板进行PCR,再以阳性管提取质粒进行酶切鉴定,排除阴性管,这样可以少提一些质粒.最近菌液PCR总是阴性,所以就直接提质粒进行鉴定了.其中原因真的不知道是什么?我也遇到过,也许是涂抹的转化产物导致的加阳性（菌落PCR）.各位大大,我倒是碰到过菌液PCR是阴性,但是有质粒的情况,酶切也正确.一般我以为质粒抽屉和酶切鉴定是最保险的.PCR假阳性.假阴性的概率都很高.菌液的问题在于盐!盐会干扰PCR.如果用菌液的话,可以用水洗涤离心几次,然后重悬于水,就可以了.
题外话：最近菌落PCR,阴性和阳性对照经常不扩增,而样品扩增,郁闷啊.