定量PCR技术简介
目录
- 1 拼音
- 2 英文参考
- 3 广义概念
- 3.1 分类
- 3.2 检测模式
- 4 狭义概念
1 拼音
dìng liàng PCRjì shù
2 英文参考
Polymerase Chain Reaction
定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
3 广义概念
3.1 分类
广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：
（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。
3.2 检测模式
PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：
（1）R Green I 检测模式。
温度循环为94—55—72℃三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。
（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。
温度循环为94—60℃二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个堿基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60℃延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个堿基，单个堿基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60℃，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。
（3）杂交探针（Hybridization Probes）模式。
温度循环为94—55—72℃三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`堿基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`堿基上结合第二个荧光染料。在55℃时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。
4 狭义概念
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2024-08-28 广告
