Question

蛋白质分离提纯方法

我在大肠杆菌中表达一种蛋白后想把它提纯出来，应该用什么方法好呢？具体步骤是什么？谢谢大家了！

Answer 1

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小信缺，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一族滑种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

扩展资料：

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。

层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形滑穗辩成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

Answer 2

　　主要有四种方法：
　　1、根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的扒局透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或键陆压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
　　离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构春亮让,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质。
　　2、根据溶解度不同进行分离纯化
　　影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
　　等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
　　蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。
　　有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用。
　　萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。
　　反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。
　　3、根据电荷不同进行分离纯化
　　根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
　　在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。有研究聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。
　　离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
　　4、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
　　亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。
　　在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。

Answer 3

蛋白质分离提纯的一般原则

1. 前处理
把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态贺友，并不丢
失生物活性。常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。
超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体
，即形成很多小气泡。由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。
2． 粗分级
分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法余嫌的特点是简便、处理量大，
3． 细分级
样品的进一步纯化。样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。
结晶是最后的一步

分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；5.对配体分子的生物亲和力等。

(一)根据分子大小不同的纯化方法

1. 透析
利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。
2. 密度梯度离心。
蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。
3. 凝胶过滤
利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。大分子先被洗脱下来。小分子后被洗脱

(二)利用溶解度差别的纯化方法

1．等电点沉淀和PH的控制
蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最底点，利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。竖拍手
2. 蛋白质的盐溶和盐析
中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水相互作用加强了，因而溶解度增加
当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用的主要原因是大量中性盐的加入使水的活性降低，原来溶液的大部分甚至全部的自由基水转变成盐离子的水化水

Answer 4