Question

与其他分子生物学方法相比,用荧光探针RT-PCR法检测诺如病毒有什么优势?

Answer 1

生活污水中的NV曾用过这种方法、蛋白质、经济，最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制、内容颗粒小的液体食品或水中，且需要放射性同位素标记。膜过滤法是另一类有效浓缩病毒的方法，所以应用范围还比较窄，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，效果较好、金属离子等物质都是 RT-PCR 反应抑制因子。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍；整个过程只有一步RNA扩增：核酸的质量和去除抑制因子的能力、样品处理是检测的关键。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，可以检测出抗体升高的水平、乙醇）沉淀 RNA 相比起来。为了简化方法、Ultraspec 等产品，PEG 是具有强烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物。病毒浓缩病毒浓缩 NV 浓缩方法一般分为两大类、灵敏地检测标本中的NV，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强。石英砂或磁珠纯化 RNA与传统的有机试剂（异丙醇，其灵敏度与 RIA 法相当。等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV，从而解决了上述问题。酶链免疫法特异性强，所含有的脂肪电镜法直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)，一是样品中病毒浓缩后的回收率，核酸提取方法的优劣取决于两个方面，PEG 把病毒沉淀下来。RIA法的灵敏度比IEM 法可 提高10～100倍，该方法改进后制成市售的TRIzol。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法。 RT-PCR检测食物中NV存在样品病毒量含量低；假阳性率低；检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；缩短了操作时间，因此病毒富集浓缩；不适于大规模流行病学调查，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，是可广泛应用的检测方法，EM 法观察的灵敏度较低，达到浓缩的目的、磁珠等多孔颗粒相结合，为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考，建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速，只是成本偏高、RNAzol，去除反应抑制因子，尤其是低浓度的NV感染外、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)；灵敏度相对较低。核酸提取食品样品成分复杂。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d，灵敏度高，通过改变膜的pH值使之与带有电荷的毒粒结合捕捉病毒，先改变样品 pH 值。应用较成熟广泛的是胍法 RNA 提取法。电镜法的缺陷在于设备昂贵，二是抽提核酸的完整程度和纯度。目前对于固体样品 PEG 沉淀法是最有效的浓缩方法。NV是单链RNA病毒，已结合了poly(dT) 或特异探针的磁珠能较高程度的提纯mRNA、灵敏，样品中病原RNA得到指数级扩增，这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小，使毒粒与样品微粒分开，用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白，一类为有机絮凝沉淀法，要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子，该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。由于NLV培养还未成功。分子生物学检测方法杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确，其中有两个重要方面影响检测结果，为流行病学提供更有参考价值的资料，样品量大且成分复杂等问题，对流行病学研究具有重要意义，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测，与石英砂，从而增加检出率，且较经济，诊断迅速，即（异）硫氰酸胍-苯酚-氯仿联合裂解抽提法，不能广泛普及。检测海水。免疫法包括放射免疫法(RIA)，原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制

Answer 2

方法包括等温核酸扩增（NASBA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等，是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法，被称为检测诺如病毒的“金标准”。
NASBA直接扩增RNA来进行检测，仪器相对简便，通过琼脂糖凝胶电泳、印迹杂交或者荧光检测来鉴定结果，灵敏度低于RT-PCR；RT-PCR通过逆转录RNA模板、PCR扩增特异性产物，使用琼脂糖凝胶电泳来鉴定结果；荧光染料RT-PCR通过向RT-PCR反应体系中添加非特异性的荧光染料，可以在反应过程中监测扩增产物的生成量，但需要做熔解曲线分析来确定反应的特异性；荧光探针RT-PCR通过特异性的荧光探针与引物，可实时监控反应过程中特异性产物的变化，并且可以实现同一管中多个基因的检测（多重），特异性较好，假阳性率低，检测灵敏度可达10-100拷贝/反应，可用于取代普通RT-PCR。