实时定量PCR的结果是怎样分析的
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。
3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也知斗就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。
扩展资料：
PCR原理：
1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列毁猛饥为模板纤返，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
参考资料来源：百度百科--PCR反应
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
基线在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一敏仔腔条直线，这样的直线即基线。光域值threshold的设定，一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期桥衫。
CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。
融解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，融解曲线就会出现一尖峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个尖峰。
扩展资料：
时荧光定量PCR仪Real-Time qPCR 常见问题分析：
1、无Ct值出现
1）检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法。则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；
2）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
3）模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
4）模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2、Ct 值出现过晚（Ct>38）
1）扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；
2）PCR各种反应成分的降解或加样量不足，
3）PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3、标准曲线线性关系不佳
1）加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
2）标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释戚唯标准品；
3）引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
参考资料来源：中国知网—实时荧光定量PCR的数据分析方法
参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：
对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
注意：
1、明指必须确定扩增的特异性
2、 只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3、 2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2
4、 最好不用Syber Green
实时荧光定量PCR由于荧光物质的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，克服了常规PCR的许多缺点，具有如下优势：
①能对模板定量；
②封闭反应，无需PCR后处理，污染少，假阳性率低；
③观察和记录自动化，结果直观，避免人为判断带来的误差；
④工作效率高，利于脊亮实现高通量检测。
实时荧光定量PR的缺点表现：
①需要特殊设备以及荧光探针，成本较高；
②不能显示樱槐宽PCR产物的片段长度；
③定量准确性还有待提高。
参考资料来源：百度百科-定量PCR
实时定量PCR的结果是可以和所有核酸结合，没有特异性。
要保证特异性的话，最好用其他的方法。扩增体系中加入模板DNA的体积，比如同时10微升的体系，对照组加1微升DNA，实验组加2微升DNA，则实验组的加样量是对照组的2倍。
看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了睁物皮，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
扩展资料：
Real-Time qPCR 常见问题分析：
一、无Ct值出现
1、检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集Taqman法。
则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
2、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。
3、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
4、模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
二、Ct 值出现过晚（Ct>38）
1、扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等。
2、PCR各种反应成分的降解或加样量不足。
3、PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
三、标准曲线线性关系不佳
1、加样存在误差：使得标准品不呈梯度。
2、标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3、引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。
4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
四、负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰
1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3、镁离子浓度过高：适当降低镁蚂埋离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒。
4、模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
五、扩增效率低
1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2、反应条件不够悉差优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3、反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
常见分析角度：
1.无Ct值出现
（1）检测荧光信号的步骤有误：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；
（2）引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
（3）模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
（4）模板降解渣神缺：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2.Ct 值出现过晚（Ct>38）
（1）扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；
（2）PCR各种反应成分的降解或加样量不足，
（3）PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3.标准曲线线性关系不佳
（1）加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
（2）标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
（3）引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
（4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4.负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰
（1）引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
（2）引物浓度不佳：适当降低引物瞎塌的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
（3）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒；
（4）模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5.扩增效率低
（1）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
（2）反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；
（3）反应如辩体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
扩展资料：
实时荧光定量PCR技术原理：
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光
随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
