Question

rna聚合酶在转录起始时结合是紧密的吗

Answer 1

考点：

原核生物RNA聚合酶的各种亚基，转录起始，转录延伸过程中的化学反应，原核生物的转录终止的两种形式；

真核生物RNA聚合酶的特点，转录起始、延伸及终止。真核与原核生物RNA合成比较。

真核生物mRNA转录后5ˊ端加帽；3ˊ端加尾及mRNA链进行剪接修饰，tRNA及rRNA的转录后加工过程，内含子的剪接方式。核酶的概念、应用。

重点：

转录的反应体系，原核生物和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，各种RNA前体的加工过程。

难点：

转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），内含子的剪接过程，核酶的作用机理。

一、转录作用

（一）转录作用及其特点

转录作用是DNA指导的RNA合成作用。反应是以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下，以四种三磷酸核苷（NTP）即ATP、GTP、CTP及UTP为原料，各种核苷酸之间的3′、5′磷酸二酯键相连进行的聚合反应。合成反应的方向为5′→3′。反应体系中还有Mg2+、Mn2+等参与，反应中不需要引物参与。碱基互补原则为A-U、G-C，在RNA中U替代T与A配对。

DNA分子多为双股链的分子，在转录作用进行时，DNA双链中只有一条链作为模板，指导合成与其互补的RNA。此DNA链称为模板键，另一条链称为编码链。编码链的序列与转录本RNA的序列基本相同，只是编码链上的T在相应转录本上为U，由于转录本RNA编码基因表达的蛋白质产物，DNA的这条链也由此命名为编码链。编码链又称为有义链；模板链又称为反义链。

在多基因的双链DNA分子中，每个基因的模板不是全在同一条链上，也就是在双链DNA分子中的一条链，对于某基因是有义链，但对另一个基因则可能是反义链。

转录作用开始时，RNA聚合酶结合于基因的特定部位，在此附近DNA双键打开约17个碱基对，形成一转录泡，进行核苷酸的聚合反应。随着RNA聚合酶沿着DNA模板链向5′末端的方向移动，核苷酸的聚合反应继续进行。

（ 二）RNA聚合酶

催化转录作用的酶是RNA聚合酶。

1原核生物RNA聚合酶

大肠杆菌RNA聚合酶的结构是由五个亚基组成，为二条α链，一条β链，一条β′链和一条σ因子链，α2ββ′四个亚基组成核心酶，加上σ因子后成为全酶α2ββ′σ。σ因子与核心酶的结合不紧密，容易脱落。RNA聚合酶β亚基有促进聚合反应中磷酸二酯键生成的作用。β′亚基是酶与模板结合时的主要部分。σ因子没有催化活性，它可以识别DNA模板上转录的起始部位。

RNA聚合酶具有多种功能，①它可从DNA分子中识别转录的起始部位。②促进与酶结合的DNA双链分子打开17个碱基对。③催化适当的NTP以3′、5′磷酸二酯键相连接，如此连续进行聚合反应完成一条RNA转录本的合成。④识别DNA分子中转录终止信号，促使聚合反应的停止。RNA聚合酶还参与了转录水平的调控。

原核生物RNA聚合酶的几个特点：①聚合速度比DNA复制的聚合反应速率要慢；②缺乏3′→5′外切酶活性，无校对功能，RNA合成的错误率比DNA复制高很多；③原核生物RNA聚合酶的活性可以被利福霉素及利福平所抑制，这是由于它们可以和RNA聚合酶的β亚基相结合，而影响到酶的作用。

2.真核生物的RNA聚合酶

真核生物中已发现有四种RNA聚合酶，分别称RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Mt。

RNA聚合酶Ⅱ转录生成hnRNA和mRNA，是真核生物中最活跃的RNA聚合酶。

RNA聚合酶Ⅲ转录的产物都是小分子量的RNA，tRNA的，5SrRNA的和snRNA。

RNA聚合酶Ⅰ转录产物是45SrRNA，生成除5SrRNA外的各种rRNA。

下面小结真核生物的RNA聚合酶，见表。

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Mt

定位

转录产物

核仁

5.8S，18S，28SrRNA前体

核质

mRNA前体

U1、U2、U4、U5

SnRNA前体

核质

tRNA前体

5SrRNA前体

U6SnRNA前体

线粒体

线粒体RNAS

对利福平的敏感性利福霉素

不敏感(-)

敏感(+)

(-)

(+)

(-)

(+)

(+)

（三）启动子及终止信号

1启动子

启动子或启动部位是指在转录开始进行时，RNA聚合酶与模板DNA分子结合的特定部位。这特定部位在转录作用的调节中是有作用的。每一个基因均有自己特有的启动子。

（1）原核生物的启动子。 原核生物的启动子大约有55个碱基对长，其中包含有转录的起始点和两个区——结合部位及识别部位。

起始点是DNA模板链上开始进行转录作用的位点，标以+1，转录是从起始点开始向模板键的5′末端方向即编码链3′末端方向进行。在DNA模板上，从起始点开始顺转录方向的区域称为下游；从起始点逆转录方向的区域称为上游。

结合部位是指在DNA分子上与RNA聚合酶核心酶紧密结合的序列。结合部位的长度大约是7个碱基对，其中心位于起始点上游的-10bp处。因此将此部位称为-10区。多种启动子的-10区具有高度的保守性和一致性；它们有一个共有序列或共同序列，为5′TATAAT－3′。又称为Pribnow盒。由于在Pribnow盒中碱基组成全是A－T配对，缺少G－C配对；而前者的亲和力只相当于后者的十分之一，所以Tm值较低。因此此区域的DNA双链容易解开，利于RNA聚合酶的进入而促使转录作用的起始。

在DNA分子上还有一段识别部位，是RNA聚合酶的σ因子识别DNA分子的部位。识别部位约有6个碱基对，其中心位于上游-35bp处。所以称为-35区，其共有序列5′-TTGACA-3′。其示意图见图。

（2）真核生物的启动子。

一个真核基因按功能可分为两部分，即调节区和结构基因。结构基因的DNA序列指导RNA转录；如果该DNA序列转录产物为mRNA，则最终翻译为蛋白质。调节区由两类元件组成，一类元件决定基因的基础表达，又称为启动子；另一类元件决定组织特异性表达或对外环境及刺激应答；两者共同调节表达。

RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子与原核生物的启动子相似，也具有两个高度保守的共有序列。其一是在－25附近的一段AT富集序列，其共有序列是TATAA，称为TATA盒。TATA盒与原核的Pribonow盒相似，是转录因子与DNA分子结合的部位。其二是在多数启动子中，-70附近共有序列CAAT区，称为CAAT盒。除以上两个区域外，有些启动子上游中含有GC盒，此GC盒与CAAT盒多位于-40～110之间，它们可影响转录起始的频率。另外，有少量基因缺乏TATA盒，而由起始序列（Inr）与RNA聚合酶Ⅱ直接作用启动基础转录的开始。启动子决定了被转录基因的启动频率与精确性，同时启动子在DNA序列中的位置和方向是严格固定的，是由5′到3′方向。其示意图见图。

增强子：增强子是长约100～200bp的序列，它们与启动子不同，可以位于转录起始位点的上游，也可位于其下游。有些增强子和静息子在DNA序列中的方向是严格由5′到3′方向排列，而另外一些则是自3′向5′方向排列。增强子和静息于与其他调节元件的DNA序列是互相重叠的。

增强子具有增加启动子的作用，与启动子都可视为基因表达调控中的顺式作用元件，可与转录因子和RNA聚合酶结合，启动并调节基因转录。

RNA聚合酶Ⅰ催化转录作用生成的18S、5．8S及 28SrRNA前体，它所识别的启动子与RNA聚合酶Ⅱ所识的启动子相比，有较大的差异。

RNA聚合酶Ⅲ催化高度保守的 tRNA、5S rRNA及一些小核RNA。它识别的启动子比较特殊，启动子不位于编码基因的上游，而在编码基因的转录区内。

2终止信号

DNA分子中停止转录作用的部位，称为终止信号。终止部位在结构上有些特点，终止部位中有一段GC富集区，随之又有一段AT富集区。在GC区内有一段是反向重复序列，以致转录作用生成的mRNA在其相应序列中有互补形成的发卡式结构。对于DNA分子的AT富集区，转录生成的mRNA的3′末端中相应的有一连串U序列。

还有一种蛋白质ρ因子，它对于RNA聚合酶识别终止信号有辅助作用，又称为终止蛋白。

（四）转录过程

转录作用过程可以分为三个阶段：起始、延长及终止。

1起始

RNA聚合酶的σ因子识别DNA启动子的识别部位，RNA聚合酶核心酶则结合在启动子的结合部位。在与RNA聚合核心酶结合的Pribonow盒附近，双链暂时打开约17个碱基对长度，展示出DNA模板链，有利于RNA聚合酶进入转录泡，催化RNA聚合作用。

转录作用开始时，根据DNA模板链上的核苷酸的序列，NTP根据碱基互补原则依次进入反应体系。在RNA聚合酶的催化下，起始点处相邻的前两个NTP以3′、5′一磷酸二酯键相连接。

随后，σ因子从模板及RNA聚合酶上脱落下来，于是RNA聚合酶的核心酶沿着模板向下游移动，转录作用进入延长阶段。脱落下的σ因子可以再次与核心酶结合而循环使用。

2延长

在RNA聚合酶的催化下，核苷酸之间以3′、5′一磷酸二酯键相连接进行着RNA的合成反应，合成方向为5′→3′。在延长过程中，局部打开的DNA双链、RNA聚合酶及新生成转录本RNA局部形成转录泡。随RNA聚合酶的移动，转录泡也行进，贯穿于延长始终。

3终止

在RNA延长进程中，当RNA聚合酶行进到DNA模板的——终止信号时，RNA聚合酶就不再继续前进，聚合作用也因此停止。由于终止信号中有由GC富集区组成的反向重复序列，在转录生成的mRNA中有相应的发卡结构。此发卡结构可阻碍RNA聚合酶的行进，由此而停止了RNA聚合作用。在终止信号中还有AT富集区，其转录生成的mRNA3′末端有多个U残基。

二、转录后的加工过程

转录作用产生出的mRNA、tRNA及rRNA的初级转录本全是前体RNA，而不是成熟的RNA，它们没有生物学活性，还要在酶的作用下，进行加工才能变为成熟的，有活性的RNA。

RNA的加工过程主要是在细胞核内进行，也有少数反应是在胞质中进行。

RNA加工的类型有：

剪切及剪接：剪切就是剪去部分序列；剪接是指剪切后又将某些片段连接起来。

末端添加核苷酸：例如tRNA的3′-末端添加-CCA。

修饰：在碱基及核糖分子进行化学修饰。

RNA编辑：某些RNA，特别是mRNA自DNA模板上所获得的遗传信息，在转录作用后又发生了变化。

（一）mRNA前体的加工

1．mRNA生成的特点

(1)原核生物mRNA的生成。原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子。即几个结构基因，利用共同的启动子及共同的终止信号，经转录作用生成mRNA分子，所以此mRNA分子可编码几种不同的蛋白质。

原核生物中，细胞内没有核膜，染色质存在于胞质中，所以转录与翻译进行的场所没有明显的屏障。在转录尚未完成时，翻译就已开始了。而且，mRNA的寿命十分短暂。

（2）真核生物mRNA生成。真核生物转录作用生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只编码一种蛋白质。

真核生物的结构基因中包含有具有表达活性的编码蛋白质序列，称为外显子；还含有无表达活性的序列，称为内含子。由于内含于是插在外显子之间，所以又称为插入序列。转录生成的mRNA前体中有来自外显子部分的，也有来自内含子部分的。在加工时，前体要进行剪接作用。

2．mRNA前体的加工

原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工就表现有活性。唯一的加工作用是多顺反子mRNA在RNaseⅢ的催化下，裂解为单独的顺反子。

真核生物转录生成的mRNA要经过较复杂的加工过程。包括①5′末端加帽②3′端加尾③剪接去除内含子并连接外显子④核苷酸编辑⑤甲基化修饰。

(1)5′末端帽子的生成。步骤

①mRNA5′末端pppNp在磷酸酶作用下脱Pi，形成ppNp-。②在鸟苷酸转移酶作用下，与Gppp反应形成GpppNp-。③在甲基转移酶作用下，由腺苷蛋氨酸(SAM)提供甲基，在鸟嘌呤的N-7上甲基化，然后在连接于鸟苷酸的第一个（或第二个）核苷酸2－OH上又进行甲基化，最后成为m7GpppNmp，这就是帽子生成。

（2）3′末端多聚A尾的生成。多聚A尾的生成是多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合而成。但多聚A尾形成并不是简单地加入A，而是先要在mRNA前体的3′末端11～30核苷酸处有一段AAUAA保守序列，在U7－snRNP的协助下识别，由一种特异的核酸内切酶催化切除多余的核苷酸。随后，在多聚A聚合酶催化下，发生聚合反应形成了3′末端多聚A尾。

（3）剪接作用。

在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中，hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，成为成熟的mRNA，这就是剪接作用。

一个相同的初级转录本，在不同的组织中由于剪接作用的差异可以产生具有不同编码的mRNA，导致翻译生成不同的蛋白质产物。

在剪接作用过程中有如下一些共同的特点：

1）mRNA前体的剪切部位是在内含子末端的特定序列。内含子的序列中起始为GU；而终止于AG。

在内含子3′末端剪接点的上游20～50核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位。

内含子如果其中发生部分丢失，不一定会对剪接产生影响。3′末端或分支部位发生变异，则会导致错误的剪接。

2）套索的形成及剪除。

mRNA前体剪接过程中，先剪切下内含子，然后连接外显子。剪接的过程分两步反应进行：①内含子序列中分支部位中腺苷酸残基（A）的2′－OH攻击内含子5′末端与外显子1连接的磷酸二酯键，剪下了外显子1，而腺苷酸原来已有以3′、5′-磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基，加上此2′、5′-磷酸二酯键的连接后，形成了“套索”中间产物。②已被剪切下的外显子1的3′末端-OH攻击内含子3，末端与外显子2之间的3′、5′磷酸二酯键，链断裂，内含子以套索形式被剪切下来，同时外显子1与外显子2连接起来。 ③剪接体的生成。 在mRNA前体剪接过程去除内含子时，还有多种成分的RNA-蛋白质复合体的参与，其大小为60S，是由几种非特异的小核核糖核蛋白(UsnRNP)与mRNA前体结合而成，称为剪接体。（UsnRNA)是一族snRNA，参与剪接作用的有多种UsnRNPs。

U1snRNP识别外显子的5′末端剪接序列，并与其互补而结合。 U5snRNP，识别并结合于内含于3′末端剪接点。U2snRNP识别并结合于A序列的分支点。还有U4及U6snRNP也参加到剪接体中，起配合作用。

(4)RNA编辑

在转录产物中插入、删除或取代一些核苷酸残基，生成具有正确翻译功能的模板，此即所谓RNA的编辑作用。 编辑过程由一个或多个小分子的“指导RNA”提供mRNA的编辑信息，并作为模板指导其进行编辑，在编辑体的帮助下进行编辑。

(5)甲基化修饰

原核生物mRNA分子中不含有稀有碱基，但真核生物的mRNA中则含有甲基化核苷酸，除了在hnRNA的5′端帽子结构中含有2－3个甲基化核苷外；在分子内部还会有l－2个m6A存在于非编码区。在序列中，m6A总是位于胞苷之后，形成了…NCm6AN序列。m6A的生成是在hnRNA的剪接作用之前发生的。

（二）tRNA前体的加工

①在核酸内切酶RNaseP作用下，从5′末端切除多余的核苷酸。

②在核酸外切酶RNaseD作用下，从3′末端切除多余的核苷酸。

③核苷酸转移酶催化，3′末端加CCA-OH，为tRNA加I特有反应。

④核酸内切酶催化进行剪切反应，剪掉内含子，由连接酶连接外显子部分。

⑤ 化学修饰作用，如甲基化、脱氨基、还原反应。

（三）rRNA前体的加工

原核生物有 16S、23S及 5S三种 rRNA，这三种rRNA均存在于30S的rRNA前体中。转录作用完成后，在RNaseⅢ催化下，将rRNA前体切开产生16S、25S及 5S rRNA的中间前体。进一步在核酸酶的作用下，切去部分间隔序列，产生成熟的 16S、23S及5S rRNA，还有成熟的 tRNA。并对16S rRNA进行甲基化修饰，生成稀有碱基。与4S rRNA加I变化不大。

真核生物的核蛋白体中有18S、5．8S及5S rRNA。 5SrRNA自己独立成体系，在成熟过程中加工甚少，不进行修饰和剪切。 45S rRNA前体中包含有 18S、5．8S及 28SrRNA。在加工过程中，分子广泛地进行甲基化修饰，主要是在28S及18S中。甲基化作用多发生于核糖上，较少在碱基上。随后45 S rRNA前体经核酸酶顺序剪切下生成18S、5.8S、28S rRNA。

三、核酶

对于具有催化活性的RNA现称为“核酶”。

核酶作用方式较简单，归纳起来主要有以下几种类型：①剪切型，这类核酸能催化自身RNA或异体RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相当于内切核酸酶的作用。②剪接型，这类核酶催化自身RNA进行化学反应，首先切去自身RNA内一个核苷酸片段，再将剩余的两个片断连接起来；相当于内切核酸酶及连接酶的联合作用。③其他类型，如核苷酸转移，脱磷酸作用。

核酶的酶活性种类：①核苷酸转移作用。②磷酸二酯键水解作用。③磷酸转移反应催化作用。④脱磷酸作用。⑤限制性内切酶作用。

核酶的意义：①RNA可作为生物催化剂。②打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。③为进化先有核酸、先有RNA提供证据。④可用于制药和临床治疗。

四、RNA的复制

病毒RNA进入宿主细胞后，还可进行复制，即在RNA指导的RNA聚合酶催化进行RNA合成反应。

RNA复制酶催化的合成反应是以RNA为模板，由5′向3′方向进行RNA链的合成。RNA复制酶缺乏校对功能的内切酶活性，因此RNA复制的错误率较高，RNA复制酶只是特异地对病毒的RNA起作用，而宿主细胞的RNA一般并不进行复制。

病毒RNA复制的几种方式

（1）含正链RNA(+)的病毒(例如，噬菌体Q)：(+)RNA充当mRNA，合成蛋白

(+)RNA为模板，复制，合成(-)RNA，再以(-)RNA为模板合成(+)RNA组装成病毒颗粒。

（2）含负链RNA(-)的病毒(例如狂犬病)：由(-)RNA合成(+)RNA，再由(+)RNA合成蛋白质、(-)RNA，组装成病毒。

（3）含双链RNA的病毒(例如呼肠孤病毒)：以(-)RNA为模板合成(+)RNA，以(+)RNA为模板合成(-)RNA和蛋白，组装病毒颗粒。

（4）逆转录病毒(例如白血病毒)：由RNA反转录为DNA，以DNA为模板合成RNA，翻译蛋白质。

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