Question

qRT-PCR检测植物miRNA的表达量，内参基因选择什么最好？可以给出特意反转录引物和qRT-PCR的引物吗？

文献提到U6作为内参基因，但是发现U6的种类也有很多，应该怎么选择？U6保守性高吗？不同植物的引物可以通用吗？比如苔藓植物的和被子植物的U6引物可以通用吗？
如果用茎环法反转录miRNA，miRNA特意反转录引物和内参特异反转录引物加在同一个反应管内吗，可行性多大？有没有相关文献？假如可以加在同一管反转录，那么接下来qRT-PCR的miRNA和U6的正反引物加在同一管还是分开进行？

Answer 1

我知道和使用过的U6内参基因只有两个： RNU6-1和RNU6-2.前一个就是常见的u6，后一个有时被称为u6b. 在我的大鼠RNA样本当中，u6表达量有些太高，u6b的Cq值与我的目标miRNA比较接近，稳定性也很好。但是这些对植物样本中的内参基因选择没有什么指导意义。

为了确定u6在植物中的保守性，比较快捷的办法是找到谈论这个话题的文献综述。如果没有人写过这样的综述的话，就只能靠自己去数据库找到所有序列自己对比了。

关于内参基因的选择，必须实验确定特定样本中的表达水平稳定，其他文献中报导的内参基因不一定适合你的样本。做新的课题时，选择内参基因一般是选取3-5个常用的，PCR测试后选取。

这里有applied biosystem一篇非常好的文章讨论内参基因，里面有很多建议和备选，但都是人和小鼠中测试的。我贴链接不方便，麻烦你自己把点和斜换成标点以后使用：
www3点appliedbiosystems点com斜cms斜groups斜mcb_marketing斜documents斜generaldocuments斜cms_044972点pdf

以上公司的miR PCR是茎环法，也是我使用过的，两个引物不在同一个管内，两个步骤也是完全分开先后进行的。暂时没有看到他们有内参和目标基因在同一反应管进行的miR PCR产品， 因为他们的PCR探针都用的同一种荧光。如果楼主感兴趣RT-PCR一步反应的，并且内参能够与目标miR在同一反应体系进行的产品，还要去咨询各大厂商。

追问

如果是同一科的植物，内参基因可以 一样吗？

追答

可以。如果使用同样引物的话，也需要确认引物结合部位序列保守。
合格的内参基因说白了只有一个要求：就是在你所有的实验组中表达水平一致，不受你实验条件的影响而改变。

追问

追答

哦，mRNA常用的universal RT不适合于miRNA是有原因的。因为mRNA常用的通用反转录引物是oligo dT，即TTTTTTT..., 识别的序列是mRNA3端的polyA。这个序列miRNA是没有的。

但不是说因此miRNA就必须分别做特异引物的反转录。因为通用反转录还有一个办法就是使用很多随机序列引物的混合物。之前没有提到是因为applied biosystem这家公司采取的并不是这种办法。如果楼主感兴趣miRNA通用反转录的试剂盒，请看看exiqon的产品。他们在业内也非常知名。

在准确移液相同数量样本模板到各个反应管的前提下，内参和目标miR不在同样反应体系中扩增不造成问题。从文献数据，厂商测评，我自己实验室实际经验三方面来说，都说明实验结果的准确性不存在问题。内参和目标miR在相同反应管中进行的最大优点其实是在高通量实验中，大大节省样本和各种试剂用量，减少总反应数目。但楼主也需要注意到这种做法的缺点：不同引物对在同一反应中，无法避免会对反应体系的各种资源产生竞争，如与聚合酶的结合以及对dNTP的消耗，两个引物对的比例可能需要在实际样本中测试，根据内参与目标miR的表达水平差异，来优化调整。此外，不同探针之间的荧光信号也无法避免会有少量泄露到对方的通道，需要校正。这些前期优化实验投入很大，不是高通量的项目（比如需要比较几百上千的样本），也不值得去做。

不管是探针法还是染料法，半定量还是绝对定量，都建议楼主在做新的引物对，或者新的样本类型之前，做一下标准曲线确定扩增效率。

关于引物适合哪些物种的问题，楼主已经反复问了很多遍了。这种问题没有捷径，不能由原理或经验推测来回答。就好像你问你看到一双鞋子某某穿着合适，想知道你自己穿着是否合适，又问是否因为某某是你表姐，所以你跟她买一样的应该就合适。或者担心表姐试过的不见得合适，自己又去淘宝另外看了十几双，来问我这里面该选哪双。我只有说，楼主你不自己去试我怎么知道？之前我也说了，自己试包括两个层面：一是序列对比，确定引物能够结合以及具备特异性，这相当于你脚穿进去之前，起码要看好鞋的号码大小，号码不对也没必要试穿了；二是实际实验测试，确定在你样本中的稳定性，这相当于鞋子要穿到脚上，冬天穿的要穿厚袜子试，春秋鞋款要穿薄袜子试，还要走两步，舒不舒服只有试了才知道。