Question

许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'基因，其编码的产物B-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀

许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'基因，其编码的产物B-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色．基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如图．请据图回答：（1）基因工程中，构建基因表达载体的目的是______．（2）限制酶EcoRI的识别序列和切点 是-G′AATTC-，Sma I的识别序列和切点是-CCC′GGG-．图中目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接相应的末端，连接的末端序列是______，连接过程中需要的基本工具是______．（3）转化过程中，大肠杆菌应先用______处理，使其处于能吸收周围 DNA的状态．（4）菌落颜色为白色的是______，原因是______．（5）菌落③中的目的基因是否能表达，可采用的检测办法是______．

Answer 1

（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用．
（2）由图可知，目的基因的左侧有限制酶EcoRI的识别序列，右侧是限制酶Sma I的识别序列，而质粒上只有限制酶EcoRI的识别序列，所以需要用限制酶EcoRI来切割质粒，用限制酶EcoRI和Sma I来切割含有目的基因的外源DNA分子，这样就使目的基因右侧无法与质粒连接，所以目的基因被切割下来和质粒连接之前，需在目的基因的右侧连接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA，连接过程中需要DNA连接酶．
（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞之前，应先用Ca²⁺处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围DNA的感受态．
（4）用限制酶EcoRI切割质粒时，会破坏质粒上的lacZ'基因，但切割后的质粒自身环化后，lacZ'基因又被修复，能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，所以菌落①②呈现蓝色；菌落③导入的是重组质粒，其lacZ'基因被破坏，不能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落颜色为白色．
（5）检测目的基因是否表达产生蛋白质，可采用抗原一抗体杂交法．
故答案：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用
（2）-TTAA  DNA连接酶
（3）Ca²⁺
（4）菌落③lacZ'标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出3-半乳糖苷酶，故菌落为白色  
（5）抗原一抗体杂交