elisa操作中有哪些注意事项
2018-06-26 · 专注各类elisa试剂盒、血清抗体
南京金益柏生物科技有限公司
ELISA实验通用规则
1、要保证移液枪的准确性,误差不能超过2%.可用水和电子天平进行确定.但最好有专业人员进行矫正.
2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支.吸取不同的液体后,要更换枪头.即使是吸取标准品时.
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出,使各种试剂都恢复到室温,以使结果更稳定.
4、实验时,要使底物避光保存.
5、用枪吸取液体时速度不能太快,以免产生气泡而使吸取量不准确.
6、吸取液体时,要用量程和需要量接近的枪去吸,减少误差.
7、将液体加到酶标孔中时,避免枪头和孔内液体接触,可使枪头上的液滴和孔壁接触,液滴会自然流下去.
8、液体全部加完后,可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒,混匀液体.也可以用酶标仪的晃动功能.
9、温浴时,要用不干胶或胶带纸封好酶标板,防止水分的蒸发.
10、洗板时,每次洗液加入后,应静置1分钟,使清洗更加彻底.没有洗板机时,倒去液体后,要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干.
11、洗液不够时,可用蒸馏水自行配制PH7.4,0.02M的磷酸缓冲液,加入0.1%的吐温20作为洗液.加入1/1000的叠氮钠后可长期保存.
12、底物是光敏感的,要在临用前现配.
13、检测前,要打开酶标仪,使之稳定10分钟以上.
14、底物有一定的毒性,终止液对皮肤有腐蚀性,应尽量避免接触.
15、待检样品要澄清,否则会影响结果.
16、温浴时间应遵守试剂盒规定.
17、应尽量做双孔实验,这样才能保证数据的准确性.
18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证.
二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法
1.加入反应终止液后,没有吸光值或吸光值偏低.
a.原因：未加入酶标记物.
解决办法：请按照操作步骤进行.
b.原因：试剂盒内容物未能充分回.
解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作.
c.原因：室温太低.
解决办法：若室温太低(25℃).
解决办法：若无法降低室内温度,请适当缩短步骤4的温育时间.
b.原因：底物溶液受到污染.
解决办法：若发现底物溶液已呈现淡蓝色,请不要再使用.
c.原因：反应时间超过太久.
解决办法：请控制反应时间.
d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂.
解决办法：使用过的吸头应立即丢弃,可避免试剂间相互污染,凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净.(先以漂白水浸泡,再以清水冲洗干净,可确保无残留)
4.阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值.
a.原因：微孔中的试剂未能充分混合.
解决办法：试剂加完后,需轻敲盘四周使其充分混合均匀.
b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.).
解决办法：请参考2-f.
c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致.
解决办法：请参考2-d.
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收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存，保存温度为4℃-8℃。
2.回温。
试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温，回温时间为40-60分钟。回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用。
3.样品稀释。
样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。如稀释倍数过大，可采用多步法进行样品稀释。例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释，可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中，充分混匀后，再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可。
4.加样。
稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中，尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔，样品加好后马上开始计时。
5.洗板。
样品孵育时间结束后，马上甩去孔内液体。如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸上，再依次进行洗涤。使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次。未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月。
6.显色。
底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中，混合直到完全溶解。本试剂最好是现用现配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。
7.终止及读数。
提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数。
8.同批号试剂盒中的试剂，除酶标二抗及阳性对照外，其余均可通用。
9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对。
10.实验室管理
桌面保持整洁，插枪头戴手套等。
