Question

【文献分享】多种蛋白质翻译后修饰在植物免疫中的作用

Answer 1

这次分享近期发表在 Nature 上的文章， “Ligand-induced monoubiquitination of BIK1 regulates plant immunity”

当植物感知到多种MAMPs的时候，BIK1先被磷酸化、再被泛素化，并从FLS2和BAK1复合物中解离，动态调控内吞作用。E3连接酶RHA3A和RHA3B介导了BIK1的单泛素化，这对于BIK1从FLS2和BAK1复合物中解离至关重要。我们的研究揭示了蛋白磷酸化和泛素化对PRR-RLCK复合物激活的相互交织调控，并表明配体诱导的单泛素化作用促进了BIK1家族的RLCKs从PRR复合物中释放并激活PRR信号。

Ligand-induced increase in BIK1 puncta

BIK1-GFP定位在表皮细胞外围和一部分的胞内区室。并且BIK1-GFP的丰度在经过flg22处理后增加(3-17min和18-32min)，而FLS2-GFP的丰度在处理后35min增加。配体诱导的FLS2的内吞作用导致激活的FLS2受体的降解和信号的衰减，而BIK1-GFP的丰度增加则先于FLS2-GFP丰度的增加。

Ligand -induced BIK1 monoubiquitination

E3连接酶 PUB12和PUB13介导了配体诱导的FLS2的降解，它们能多泛素化FLS2。然后我们猜测，使用flg22处理后，BIK1是否被泛素化。拟南芥原生质体的泛素化试验和pBIK1:BIK1-HA稳转材料中共同揭示flg22诱导了BIK1的泛素化【FLAG-UBQ(ubiquitin)】,根据蛋白条带大小可以推断大概是8kDa，也就是单泛素化。使用小鼠的去泛素化酶USP2-cc，可发现凝胶迁移消失。除了flg22外，其他的MAMPs，如elf18，pep1和chitin也诱导了BIK1的单泛素化；BIK1的RLCKs家族的其他成员PBL1和PBL10单泛素化加强，揭示了感知到MAMPs后诱导了BIK1家族RLCKs的单泛素化。

感知到flg22后，1min内BIK1被磷酸化，10min左右达到平稳。而flg22诱导的BIK1的单泛素化在处理10min后发生，30min达到平稳，因此flg22诱导的BIK1，先发生磷酸化，再发生泛素化。BIK1磷酸化缺陷突变体展示出flg22诱导的泛素化减弱，且施加K252a(激酶抑制剂)阻断了flg22诱导的BIK1泛素化，因此这就说明flg22诱导的质膜上BIK1的磷酸化是泛素化的先决条件。

BIK1 ubiquitination by RHA3A and RHA3B

BIK1中有30个lys残基，每一个都有可能被泛素化。酵母双杂交筛选到E3连接酶，RHA3A，并用pull down和Co—IP证明了与BIK1的互作。RHA3A的同源基因RHA3B也与BIK1互作，并且flg22的处理并不影响BIK1与RHA3A/B的互作。GST-RHA3A，而不是GST-RHA3A(I104A,保守的Ile位点)导致分子量上近似8kDa的差异。在rha3a/b突变体中，flg22诱导的BIK1的单泛素化减少。这些结果说明RHA3A/B塑造了flg22诱导的BIK1的单泛素化。

Sites of RHA3A-mediated BIK1 ubiquitination

使用LC-MS鉴定RHA3A介导的BIK1泛素化位点，得到10个lys位点。一个位点在ATP结合区，六个在BIK1的表面。单个的lys突变并不会影响BIK1在的泛素化，BIK1中九个lys都突变后(9KR)flg22诱导的BIK1的单泛素化消失，但其体外的激酶活性没有受影响。这些结果说明RHA3A单泛素化BIK1，BIK1的磷酸化并不需要单泛素化。单泛素化也许是BIK1修饰的初级形式，而BIK1的多泛素化是很短暂的。

BIK1 monoubiquitination in immunity

与pBIK1::BIK1-HA/bik1相比，pBIK1::BIK1 9KR -HA/bik1展示出与bik1相似的减少的flg22激发的ROS爆发，并且对DC3000 hrcC-更感病。RHA3A/B介导了BIK1的单泛素化在调节ROS产生和植物免疫中发挥重要作用。

BIK1在内吞作用的单泛素化

不足之处
1.F1f不能解释没用flg22处理时，为何会有条带，是不是BIK1本底的泛素化。
2.某一位点多泛素化和多个位点的单泛素化并没有严格分清。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2210-3