Question

生物样品中蛋白质的处理方法有哪些

Answer 1

① 盐析法
一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析.在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如蛋白质、多肽、多糖、核酸等,其中以蛋白质沉淀最为常见,特别是在粗提阶段.
盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.
② 有机溶剂沉淀法
　有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛.其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行.总体来说,蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍.
　　有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.
③ 其他沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时,在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质,再调PH3.0去除酸性蛋白质.
利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性,不然盲目使用十分危险.不少蛋白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必须注意调整PH值.等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力.
　　二．生成盐复合物沉淀法
　　1．金属复合盐法
许多有机物质包括蛋白在内,在碱性溶液中带负电荷,能与金属离子形成沉淀.根据有机物与它们之间的作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类,如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类,如概镁铅；亲硫氢基化合物类,如汞银铅.蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感,调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂）,即可沉淀多种蛋白.
　　2． 有机盐法
　　含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出.但此法常发生不可逆的沉淀反应,故用于制备蛋白质时,需采用较温和的条件,有时还需加入一定的稳定剂.
　　3．无机复合盐法
　　如磷钨酸盐、磷钼酸盐等.
　　以上盐类复合物都具有很低的溶解度,极易沉淀析出.若沉淀为金属复合盐,可通以H2S使金属变成 硫化物而除去,若为有机酸盐或磷钨酸盐,则加入无机酸并用乙醚萃取,把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去,或用离子交换法除去.值得注意的是此类方法常使蛋白质发生不可逆沉淀,应用时必须谨慎.
三． 选择性变性沉淀
　　其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同,有选择地使之变性沉淀,以达到分离提纯的目的.
　　此方法可分为：1）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分,而保存另一些组分；3）酸碱变性.
　　四．非离子多聚物沉淀法
　　非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂,最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒,近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯.这类非离子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等,其中应用最多的是聚乙二醇.
用非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒,一般有两种方法：1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系,不等量分配,而造成分离.此方法基于不同生物分子表面结构不同,有不同分配系数.并外加离子强度、PH值和温度等影响,从而扩大分离效果.2）选用一种水溶性非离子多聚物,使生物大分子在同一液相中,由于被排斥相互凝聚而沉淀析出.该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒,调整溶液PH值和温度至适度,然后加入中性盐和多聚物至一定浓度,冷贮一段时间,即形成沉淀.
黑雪酱y8V2014-09-23