Question

对dna降解进行测定，目前最常用的是碘化丙啶染色，进行细胞周期分析，观察是否有

Answer 1

PI单染检测细胞周期
原理：
碘化丙啶(Propidium ，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

操作步骤：
1、对于悬浮细胞，直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rmp下用预冷的PBS洗细胞两次；对于贴壁细胞，先用不含EDTA的0.25%的胰酶消化再离心收集细胞；
2、加入预冷的70%乙醇（PBS配制），于4℃固定过夜，或-20℃长期固定；
3、离心收集细胞，以1 mL预冷的PBS洗细胞一次，加入预冷的 PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×106，取出100 ul细胞悬液，加入RNase A酶，使RNase A终浓度为1 mg/ml，混匀后37 ℃水浴30 min；
4、加入PI综合染色液，使PI终浓度为50 ug/mL，混匀，4℃冰箱避光保存；
5、300目尼龙网过滤后，上机检测。

注意事项：
1、细胞浓度一定要≧1×106/ml，特别是阴性对照管细胞量要大一些，以便样品电压调节；
2、必须保证被检测样品为单细胞悬液；
3、如果样品细胞为培养的贴壁细胞，将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞），与不含EDTA的胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞；
4、在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞悬液；
5、RNAse与PI综合染液分开的原因是RNAse的作用最适温度是37℃，而不是4℃，所以与教材有所不同；
6、PI综合染液不能用蒸馏水配，否则细胞全部溶解，造成结果不可靠；
7、4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料显示-20℃可以至少保存一个月；
8、70%~75%的酒精都可以用于PI单染固定。