Question

细菌转化实验步骤

Answer 1

细菌转化实验步骤如下：

1、事先将恒温水浴的温度调到42℃。

2、从-70℃超低温冰柜中取出一管100μL感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5到10min。

3、加入5μL连接好的质粒混合液 DNA含量不超过100ng，轻轻震荡后放置冰上20 min。

4、轻轻摇匀后插入42℃水浴中1到2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3到5min。

5、在超净工作台中向上述各管中分别加入500μL、LB培养基 不含抗菌素轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上，37℃、120rpm震荡1h。

6、在超净工作台中取上述转化混合液100到300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。

7、如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μL 2% X-gal，7μL 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

8、在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

9、在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

10、观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。